疗卫生机构消毒技术规范和疫源地消毒技术规范

1.1 引言

根据《中华人民共和国传染病防治法》、《中华人民共和国传染病防治法实施办法》和《消毒管理办法》制订本规范。本规范含总则、消毒检验技术规范、医疗卫生机构消毒技术规范和疫源地消毒技术规范四个部分。

1.2适用范围 

本规范适用于在中华人民共和国境内生产、经营、使用和检验消毒产品的组织，医疗卫生机构以及传染病疫源地和其他一切需要消毒的场所。

1.3术语

1.3.1 消毒 disinfection

杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。

1.3.2 灭菌 sterilization

杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。

1.3.3 化学指示物 chemical indicator

利用某些化学物质对某一杀菌因子的敏感性，使其发生颜色或形态改变，以指示杀菌因子的强度(或浓度)和/或作用时间是否符合消毒或灭菌处理要求的制品。

1.3.4 生物指示物 biological indicator

将适当载体染以一定量的特定微生物，用于指示消毒或灭菌效果的制品。

1.3.5 消毒剂 disinfectant

用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。

1.3.6 灭菌剂 sterilant

可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。

1.3.7 高效消毒剂 high-efficacy disinfectant

指可杀灭一切细菌繁殖体（包括分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子等，对细菌芽孢（致病性芽孢菌）也有一定杀灭作用，达到高水平消毒要求的制剂。

1.3.8 中效消毒剂 intermediate-efficacy disinfectant

指仅可杀灭分枝杆菌、真菌、病毒及细菌繁殖体等微生物，达到消毒要求的制剂。

1.3.9 低效消毒剂 low-efficacy disinfectant

指仅可杀灭细菌繁殖体和亲脂病毒，达到消毒要求的制剂。

1.3.10 有效氯 available chlorine

有效氯是衡量含氯消毒剂氧化能力的标志，是指与含氯消毒剂氧化能力相当的氯量(非指消毒剂所含氯量)，其含量用mg/L或%浓度表示。（有效碘及有效溴的定义和表示法与有效氯对应）。

1.3.11 中和剂 neutralizer

在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。

1.3.12 中和产物product of neutralization

指中和剂与消毒剂作用后的产物。

1.3.13 菌落形成单位 colony forming unit，cfu

在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。

1.3.14 自然菌 natural bacteria

在消毒试验中，指存在于某一试验对象上非人工污染的细菌。

1.3.15 存活时间 survival time， ST

用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本有菌生长的最长作用时间 (min)。

1.3.16 杀灭时间 killing time， KT

用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本无菌生长的最短作用时间 (min)。

1.3.17 D 值 D value

杀灭微生物数量达90%所需的时间(min)。

1.3.18 杀灭对数值 killing log value

当微生物数量以对数表示时，指消毒前后微生物减少的对数值。

1.3.19 杀灭率 killing rate， KR

在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值。

1.3.20 灭菌保证水平 sterility assurance level，SAL

指灭菌处理后单位产品上存在活微生物的概率。SAL通常表示为10-n。如，设定SAL为10-6，即经灭菌处理后在一百万件物品中最多只允许有一件物品存在活微生物。

1.3.21 疫源地消毒 disinfection of epidemic focus

对存在或曾经存在传染源的场所进行的消毒。

1.3.22 随时消毒 concurrent disinfection

有传染源存在时对其排出的病原体可能污染的环境和物品及时进行的消毒。

1.3.23 终末消毒 terminal disinfection

传染源离开疫源地后进行的彻底消毒。

1.3.24 预防性消毒preventive disinfection

对可能受到病原微生物污染的物品和场所进行的消毒。

1.3.25 无菌检验 sterility testing 

证明灭菌后的物品中是否存在活微生物所进行的试验。

1.3.26 生物负载 bioburden

被测试的一个单位物品上承载活微生物的总数。

1.3.27 暴露时间 exposed time

消毒或灭菌物品受到消毒因子作用的时间。又称作用时间、处理时间。

1.3.28 人员卫生处理 personnel decontamination

对污染或可能被污染人员进行人体、着装、随身物品等的消毒与清洗等除污染处理。

1.3.29 载体 carrier

试验微生物的支持物。

1.3.30 抗菌antibacterial

采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。

1.3.31 抑菌bacteriostasis

采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。

1.4 消毒产品功效检验的基本原则和要求

1.4.1 消毒产品检验的基本要求

1.4.1.1 消毒实验室的基本要求

检验机构的微生物实验室应采取封闭式布局，建筑应便于清洁、消毒。为避免污染应在相对正压洁净条件下进行，但有时因特殊需要，用致病菌作指示菌时，则应在生物安全柜（负压）内进行。对无菌产品的无菌检查试验， 必须在100 级洁净度的实验室，或100 级层流操作柜中进行。

1.4.1.2 无菌操作的基本要求 

（1）试验开始前，应以湿式方法清洁台面和打扫室内地面，然后以紫外线或其他方法对实验室内空气进行消毒；

（2）实验人员应穿戴工作服、口罩、帽子；进行无菌检验时，需经风淋后进入实验室，然后，正确穿戴好无菌隔离衣、帽和口罩；

（3）每吸取一次不同样液应更换无菌吸管，接种环（针）需在火焰上烧灼灭菌后，才可再次使用；

（4）要求无菌的试剂，如蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、牛血清白蛋白、标准硬水、中和剂等，均需灭菌或过滤除菌；

（5）无菌器材和试剂，使用前须检查容器或包装是否完整，有破损者不得使用；

（6）正在使用的无菌器材和试剂不得长时间暴露于空气中；

（7）移液或接种时，应将试管口和琼脂平板靠近火焰，防止污染；

（8）所有用过的污染器材，应立即放入盛有消毒液的容器中，以防止对周围环境和清洁物品造成污染；

（9）若不慎发生微生物培养物摔碎或其他试验微生物泄漏事故时，不论是否具有致病性，均应立即对污染及可能波及的区域进行消毒处理；

（10）全部试验结束后，应按常规对室内空气和环境表面进行消毒处理。

1.4.1.3 试验样品批次（件）的要求

（1）消毒剂样品，送检单位应送检3批样品，样品包装和标识应与拟销售产品完全相同，在理化试验时，需检测3批样品，每批取1个样品平行测定2次，取平均值报告结果。在杀灭试验时，取3批样品中含量最低者进行试验。在毒理试验中，取3批样品中含量最高者进行试验。

（2）消毒器械，送检单位应送检3件样品，大型器械可送检1件样品，标识应与拟销售产品完全相同。

（3）化学指示物、生物指示物、灭菌包装、卫生用品和1次性使用医疗用品，送检单位应送检3批样品。

1.4.1.4试验的基本要求

（1）依据申报单位提供产品研制报告和产品的使用说明书进行检验。

（2）用于评价消毒剂消毒效果的实验室试验应以悬液定量法为主，试验须重复3次。

（3）用于评价医疗器械灭菌的消毒剂和消毒器械灭菌的功能鉴定试验应用载体定性法，试验应重复5次。在无特殊要求的情况下，一般以不锈钢圆片为载体。

（4）对不宜用悬液定量法评价的消毒剂，如粘稠的消毒剂和冲洗消毒的消毒剂等的实验室试验用载体定量法，试验应重复3次。在无特殊要求的情况下，以布片为载体。

（5）评价消毒剂消毒效果的实验室试验，试验浓度要用产品说明书规定的该消毒剂对某一有代表性消毒对象的最低使用浓度。试验设3个不同作用时间，原则上第一时间为说明书规定的最短作用时间的0.5倍，第二时间为最短作用时间，第三时间为最短作用时间的1.5倍。对多用途的消毒剂，消毒对象所涉及的微生物相同时，若使用浓度相同，选择各种用途中最短的作用时间。若使用时间相同，选择各种用途中最低的使用浓度。使用浓度低，作用时间短者与使用浓度高和作用时间长者同时存在时，以前者为准。使用浓度高，作用时间短者与使用浓度低，作用时间长者同时存在时，每个剂量均须进行试验。

评价消毒剂灭菌效果的模拟现场灭菌试验，应用产品说明书规定的最低使用浓度和0.5倍的最短作用时间进行试验。评价消毒剂消毒效果的现场或模拟现场试验，应用产品使用说明书的最低有效浓度和最短作用时间进行试验。

（6）在对消毒剂进行监督监测时，定量杀菌试验的消毒剂浓度和作用时间选择消毒对象中抗力最强的微生物，以说明书规定的最低浓度和最短时间验证其消毒效果。对用于灭菌的消毒剂则以说明书中规定的使用浓度和其0.5倍的作用时间验证其灭菌效果。

（7）鉴定和监测多用途消毒剂与消毒器械消毒效果时，现场或模拟现场试验的消毒对象原则上是在类似物品中最难达到消毒合格者，如医疗器械消毒或灭菌选用止血钳；皮肤消毒选择人体前臂屈面皮肤；织物消毒选择棉布；一般物品表面（包括木质、塑料、橡胶、玻璃）消毒选择木质表面；餐具消毒选用竹(木)筷，不用于筷子消毒的可选用瓷质碗盘；地面消毒选择水泥地面；手消毒选择五指屈面；对于特指消毒对象而又在上述物品中不能选出有代表性物品时，则需用该特指对象进行试验。

（8）对于经过充分清洗的消毒对象专用的消毒剂，可按其使用方法，在杀菌试验时可减低干扰物的浓度。

1.4.1.5 消毒产品鉴定测试项目的确定

（1）有效成分含量的测定：有效成分系指具有杀菌作用的成分。所有化学消毒剂均应进行本项检测。所测含量在产品有效期内，不得低于企业标准的下限值。复方化学消毒剂测其杀菌主要成分的含量。植物消毒剂和用其提取物配制的消毒剂可不测定有效成分。

（2）pH 值的测定：所有消毒剂需测定消毒剂原液的pH 值，固体消毒剂应测定最高应用浓度的pH值。对于需调节pH后使用的消毒剂则应在pH调节剂加入前后分别测定pH值。

（3）稳定性试验：所有消毒剂均应进行稳定性试验，可用加速实验法37℃，90d和/或54℃，14d；也可选用室温留样法。以化学成分为主的消毒剂，用化学法进行稳定性实验；以植物为主要有效成分的消毒剂，用微生物法进行稳定性实验；以化学成分和植物为有效成分的消毒剂，同时用化学法和微生物法进行稳定性实验。

（4）金属腐蚀性试验：用于金属物品消毒的消毒剂应进行本项检测，试验浓度应选择最高使用浓度。

（5）微生物杀灭试验：所有消毒剂均应进行本项检测。试验前， 必须先按不同种类的试验微生物分别进行相应的化学中和剂或其它残留消毒剂去除法的鉴定试验，选出适宜的中和试验微生物以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表；大肠杆菌(Escherichia  coli)8099作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 15442作为医院感染中最常分离的细菌繁殖体的代表；白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)8032作为空气中细菌的代表；龟分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacterium  chelonae subsp. abscessus)ATCC 93326作为人结核分枝杆菌的代表；枯草杆菌黑色变种芽孢(Bacillus subtilis var.niger)ATCC 9372作为细菌芽孢的代表；白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10231和黑曲霉菌(Aspergillus niger)ATCC 16404作为致病性真菌的代表；脊髓灰质炎病毒-Ⅰ型疫苗株(Poliovirus-Ⅰ)作为病毒的代表。

在上述规定的菌、毒株的基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌、毒株。

不同用途的消毒剂和消毒器械，实验室杀灭微生物试验的代表微生物应按照表1-1所列者选择。若特指对某微生物有效时，则需进行相应微生物的杀灭试验。

对于专用于灭菌，不作它用的消毒剂，只需做枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭试验，可不做病毒、真菌、分枝杆菌及细菌繁殖体杀灭试验，但对既用于灭菌，又用于消毒的消毒剂则按上述要求选择相应微生物进行试验；对枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭达到消毒要求（杀灭对数值≥5.00）的消毒剂，在不低于此浓度用作消毒时可不作病毒、真菌和分枝杆菌杀灭试验。

表1-1  杀灭试验中微生物的选择

【注】表中‘+’为必做试验的微生物，消毒剂特指对某微生物具有杀灭作用者，则除按表中要求外，还需另选做该微生物杀灭试验。

（6）模拟现场试验与现场试验：根据不同消毒对象按如下要求选择模拟现场或现场试验:

用于、空气消毒的消毒剂须进行现场试验。

用于饮水、手、皮肤、一般物体表面消毒的消毒剂任选模拟现场试验或现场试验。黏膜消毒剂的模拟现场试验或现场试验可用皮肤代替。

用于食（饮）具、医疗器械和用品消毒的消毒剂进行模拟现场试验。其中医疗器械的模拟现场试验应区分消毒或灭菌。

1.4.1.6 消毒器械鉴定测试项目的确定

消毒器械应根据产品功能与用途要求选择以下项目进行检测。对器械、耐压或电气性能及关键部件的使用寿命等的鉴定，由相关行业计量认证考核合格的检验机构按其标准进行检测，提供检验报告。

（1）杀菌因子强度或浓度的测定

杀菌因子指消毒器械所产生的具有杀菌作用的物理或化学因子。物理因子包括热、微波、紫外线等。对物理杀菌因子应测定其规定杀菌条件下的强度，如对热力杀菌器械应测量其温度，对紫外线杀菌器材测定其辐照度值。化学因子则由消毒器械产生具有杀菌作用的化学物质，常见有次氯酸钠、臭氧、二氧化氯等，可测定所产生消毒液中有效成分的浓度。

（2）金属腐蚀性试验

主要检测杀菌器械所产生化学杀菌因子对金属的腐蚀性。其要求与消毒剂的金属腐蚀性试验相同。

（3）实验室杀灭微生物试验

用于消毒的器械，应采用定量杀灭试验;用于灭菌的器械应做定性杀灭试验。

（4）安全性试验

包括电器安全试验和消毒器械产生的化学因子的毒理学试验。

（5）模拟现场和现场试验

用于消毒及灭菌的器械均须进行模拟现场试验。消毒器械产生的化学因子按消毒剂的要求进行模拟现场或现场试验。空气消毒剂需用进行模拟现场和现扬试验。

1.4.1.7 消毒产品有效成分含量表示方法

有效成分含量以法定计量单位表示。复方消毒剂以其杀菌主要有效成分含量表示；植物消毒剂以百分浓度表示，如1份原液加4份水即该消毒剂溶液的浓度为20%。

1.4.1.8 对重复试验的要求

对所要求的重复性试验，并不是只在同次试验中增加菌片数，或多作几份样本，而是应分期分批进行。必要的器材和试剂应重新制备或灭菌，以防产生系统性误差。

中和剂鉴定试验，应将各组 3 次重复试验结果平行列出， 以便对比分析。

1.4.1.9 最终评价的要求

由于影响消毒与灭菌鉴定试验结果的因素很多，其中也包括试验的准确性和设计的科学性，所以在根据试验结果进行最终评价时应综合分析。除反复推敲试验过程和结果的准确性外，还应和国内外文献报导该消毒剂（消毒器械）的性能和不同试验方法所得结果进行比较，以判断所下结论有无不妥之处。如有不同于通常规律的结果，应重新考虑实验设计。如试验组距设置，消毒剂(器械)浓度(强度)测定和计算，实验条件(温度、湿度、pH值等)是否符合规定，特别要注意中和剂的选择试验是否符合要求等。必要时，还需要经过多种试验，多个实验室重复，查阅国内外文献，从各个角度证明，才能做出可靠的结论。

1.4.1.10 试验记录的要求

实验室对所进行的试验，必须按计量认证（或实验室认可）要求认真观察试验结果，作好原始记录。为使记录规范化，须用表格方式记录，表格中应包括样品名称与编号、检验日期、检测项目、检测依据、试验条件、使用仪器编号、观察结果、试验者和校核者签名等栏目。表格中每一栏目应用蓝黑或碳素墨水逐项填写。一次试验填写一份表格。原始记录数据和计算应及时校核，整理装订附于检验报告后，入档保存备查。

1.4.1.1 检测报告的要求

检测报告是试验情况和结果的书面表达，具有长期保存和法律价值，因此必须逐项填写清楚。因为技术规范或标准等的规定只写出共性部分，即使再详细亦难以包括所有情况和要求。各样品检测可能有其特殊性，因样品用途、用法不同，其检验条件和检验方法亦可随之改变，若检验报告中不说明其改变的情况，将会影响对所得结果做出准确的评价。凡是检验方法与本规范不一致或有更改者，必须详细叙述补充或删改的部分，以便阅读者了解检验工作的全过程，对检验样品的质量作出恰如其分的评价。

检验报告的结果部分，用表格将各试验组、阳性对照、阴性对照及其他对照组的数据列出（定性的对照可用文字加以说明）。试验组应列出其杀灭对数值，杀灭对数值≥5.00时，无须列出具体数值，当杀灭对数值≤5.00时，则应列出具体杀灭对数值。并用文字简要叙述所得的结果。

检验报告的结论部分，应根据试验结果得出明确的结论。

此外，对试验中出现某些异常现象亦应加以说明。

1.4.1.12 实用剂量的要求

日常消毒与灭菌中影响杀菌效果的因素较多，而实验室试验所规定的条件，均应控制在一个固定的范围之内，因此，需根据多种试验结果和实践经验确定。

杀菌剂量包含有两个参数，一是杀菌因子的强度，二是作用的时间。在确定实用剂量时需考虑的因素主要有：污染微生物的种类和数量；有机物的含量；杀菌因子的稳定性；环境的温湿度变化；腐蚀性的强弱；酸碱度；消毒对象的性质；允许使用的浓度；允许作用的时间；杀菌因子的穿透能力；对人体和环境的危害等。实用剂量应符合下列要求：

（1）申请检验单位应根据消毒产品的研制结果，针对不同用途，提出杀灭微生物有效、安全的实用剂量。

（2）实用剂量不低于模拟现场试验或现场试验所测得的结果。

（3）实用剂量应对人体和环境无危害，对物品无损害。

1.4.2 消毒产品理化检验基本要求

消毒剂配方中不能含有“消毒剂禁用物质”，也必须符合消毒剂限量物质要求。消毒剂有效成分必须符合我国允许的消毒剂组分。

1.4.2.1 标准品或对照品的纯度≥99.0%；用标准品或对照品进行标定过的标准溶液作为含量测定的对照物也可。

1.4.2.2 以滴定法分析有效成分时，滴定液用量不宜超过滴定管所标示的量。文内规定滴定时所取样本的质量或容量(包括浓度)，均根据此原则设定。若所测消毒剂浓度过高，可适当减少取样量或经稀释后测定，以减少测定结果的误差；若消毒剂浓度过低，可增加取样量或采用灵敏度更高的方法进行测定。

1.4.2.3 溶液或消毒剂的有效成分含量的表示，以mg/L或mg/kg为主。采用百分数表述含量时有下列2种含义：①液体和液体之间为体积百分数，用“%”表示，即100 ml溶液中含溶质若干ml，或100 ml消毒剂中含有效成分若干ml；②固体和固体之间为质量百分数，用“%”表示，即100 g消毒剂中含有效成分若干g；

对固体和液体之间采用质量浓度表示（mg/L、g/L等），即1L溶液中含溶质若干mg或g，或1L消毒剂中含有效成分若干mg或g等。

1.4.2.4 方法中所用试剂的纯度涉及基准、分析纯、化学纯及色谱纯等，未作专门说明者，一般采用分析纯。配制滴定液试剂 (如硫代硫酸钠)因配制后尚需专门处理，亦可用化学纯。

1.4.2.5 本规范中，“滴定液”是指经过标定，浓度准确至0.001 mol/L～0.0001 mol/L 的溶液。未经浓度标定者则称“溶液”，以示区别。摩尔(mole， mol) 为物质量的单位，当分子、原子或其它粒子等的个数约为6.02×1023时即为 1 mol。本规范中滴定液浓度的计算，除碘滴定液按原子量计算外，其它滴定液均按分子量计算。

1.4.2.6 滴定液的标定及所有样品测定均平行进行两次。将滴定管中滴定液补足至全量后滴定。所有试验结果(包括消毒剂有效成分测定及滴定液标定)应当以空白试验校正。所使用的滴定液应按要求在有效使用期内使用。

1.4.2.7 对仪器设备进行计量检定。玻璃仪器清洗干净，用蒸馏水冲洗3遍。所用容量瓶和量筒等不能加热。

1.4.2.8 容量分析实验室工作温度应控制在20℃～25℃。

1.4.2.9 送检3批具有代表性的样品。每批取1个样品平行测定2次，取平均值报告结果。

1.4.2.10 粉剂和片剂的取样量为测定所需量的10倍，经研磨后精确称取适量样品进行测定。

1.4.2.11 如果选用色谱法或分光光度法，进行方法可靠性论证时应附空白样品（不含被测成分的其它成分所构成的样品）、模拟样品（空白样品加有效成分的标准品）以及待测样品的色谱图或光谱图。如果无法提供空白样品，可用加入标准量法进行方法可靠性的论证。

1.4.2.12对于本规范中测定方法不适用的产品，有效成分的测定，由厂家提供检测方法及方法可靠性的论证报告，经检验机构认可后方可采用。

1.4.3 消毒产品毒理学实验基本要求

为了确保消毒剂的安全性，消毒剂除在配方组分或杂质（污染物）含量方面必须达到国家有关部门颁发的相关技术法规或强制性标准对它们的禁用或限用的要求外，消毒剂还需进行相应的安全性毒理学评价。

1.4.3.1 消毒产品毒理学实验评价程序

消毒剂安全性毒理学评价，可分为4个阶段。

(1)第一阶段 (急性毒性试验、皮肤刺激试验和黏膜刺激试验)

1)急性经口毒性试验

2)急性吸入毒性试验

3)皮肤刺激试验

4)急性眼刺激试验

5)阴道黏膜刺激试验

6)皮肤变态反应试验

(2)第二阶段 (亚急性毒性试验和致突变试验)

1)亚急性毒性试验

2)致突变试验                                    

① 体外哺乳动物细胞基因突变试验 (体细胞基因水平，体外试验)

L5178Y 细胞基因突变试验

V79 细胞基因突变试验

② 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 (体细胞染色体水平，体外试验)

③ 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 (体细胞染色体水平，体内试验)

④ 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 (体细胞染色体水平，体内试验)

⑤ 程序外 DNA 修复合成试验 (DNA水平，体外试验)

⑥ 小鼠精子畸形试验 (性细胞基因和染色体水平，体内试验)

⑦ 睾丸生殖细胞染色体畸变试验 (性细胞染色体水平，体内试验)

小鼠精原细胞染色体畸变试验

小鼠精母细胞染色体畸变试验

(3)第三阶段（亚慢性毒性试验和致畸胎试验）

1)亚慢性毒性试验

2)致畸胎试验

(4)第四阶段（慢性毒性试验和致癌试验）

1)慢性毒性试验

2)致癌试验

1.4.3.2 各种消毒产品毒理学试验的规定

为便于对消毒剂进行毒理学评价，将消毒剂分为三类。

(1)第一类消毒剂：指我国首创或根据国内外文献报道首次生产的消毒剂。原则上需进行上述4个阶段的毒理学试验。首先必须做急性经口毒性试验(包括小鼠和大鼠)、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验和三项致突变试验(包括反映体细胞基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平三种类型试验)。根据试验结果，判断是否需继续做其它试验项目。

(2)第二类消毒剂：指国外已批准生产、现由我国首次生产或首次进口的消毒剂。首先必须做急性经口毒性试验、亚急性毒性试验和两项致突变试验 (包括反映基因水平和染色体水平两种类型试验)。根据试验结果，判定是否需继续做其它项目试验。

(3)第三类消毒剂：指与国内已获准生产的消毒剂属于同类的产品或植物成分组配的消毒剂。首先必须做急性经口毒性试验和一项致突变试验(反映体细胞基因水平或染色体水平类型的试验) ；若消毒剂（皮肤黏膜消毒剂）直接用于人体，并有可能重复接触的，还必须增做亚急性毒性试验。根据试验结果，判定是否需继续做其它试验。

(4)室内空气消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须做急性吸入毒性试验和急性眼刺激试验。视其试验结果，判定是否需做其它试验项目。

(5)手和皮肤消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须进行完整皮肤刺激试验。如果偶尔使用或间隔数日使用的消毒剂，采用一次完整皮肤刺激试验；如果每日使用或连续数日使用的消毒剂，采用多次完整皮肤刺激试验。接触皮肤伤口的消毒剂，还必须增做一次破损皮肤刺激试验；接触创面的消毒剂，应增做眼刺激试验。使用过程中，必需接触皮肤的其它消毒剂，也应增做完整皮肤刺激试验。根据消毒剂的成分，估计可能有致敏作用者，还需增做皮肤变态反应试验。

(6) 黏膜消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须做急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验。如果偶尔使用或间隔数日使用的消毒剂，采用一次阴道黏膜刺激试验；如果每日使用或连续数日使用的消毒剂，采用多次阴道黏膜刺激试验。

1.4.3.3 毒理学试验用消毒产品样品的规定

（1）受试样品必须是按照既定的生产工艺和配方进行规范化生产的消毒产品，其成分和浓度与实际生产和销售的相同。

（2）提供受试样品与毒性有关的物理、化学性质的资料，以及消毒剂的配方、主要成分的化学结构和含量、pH值等，但植物成分组配的消毒剂可不提供化学结构。

（3）进行安全性毒理学评价用受试物

根据不同毒理学试验的目的，采用相应的受试物。

1）在急性经口毒性试验、急性吸入毒性试验、亚急性毒性试验、致突变试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验、慢性毒性试验和致癌试验时，一般采用消毒剂原形样品。消毒剂原形是指在销售过程中原包装的粉剂、片剂或原液。对于二元或多元包装的消毒剂，以按比例混合配制后作为消毒剂原形。

2）在皮肤刺激试验、急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验中所用受试物的浓度，通常是对皮肤、黏膜消毒时应用浓度的 5倍。使用原形（原液）对皮肤、黏膜进行消毒的消毒剂，则采用消毒剂原形（原液）作为试验受试物，不需对消毒剂原形再进行浓缩。

3）在皮肤变态反应试验时，采用的诱导浓度应为引起皮肤刺激反应的最低浓度或原液，激发浓度应为不引起皮肤刺激反应的最高浓度或原液。

1.4.4 医疗卫生机构消毒、灭菌基本要求

1.4.4.1消毒因子作用的水平

根据消毒因子的适当剂量（浓度）或强度和作用时间对微生物的杀灭能力，可将其分为四个作用水平的消毒方法。

（1）灭菌：可杀灭一切微生物（包括细菌芽孢）达到灭菌保证水平的方法。属于此类的方法有：热力灭菌、电离辐射灭菌、微波灭菌、等离子体灭菌等物理灭菌方法，以及用甲醛、戊二醛、环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢等消毒剂进行灭菌的方法。

（2）高水平消毒法：可以杀灭各种微生物，对细菌芽孢杀灭达到消毒效果的方法。这类消毒方法应能杀灭一切细菌繁殖体（包括结核分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子和绝大多数细菌芽孢。属于此类的方法有：热力、电力辐射、微波和紫外线等以及用含氯、二氧化氯、过氧乙酸、过氧化氢、含溴消毒剂、臭氧、二溴海因等甲基乙内酰脲类化合物和一些复配的消毒剂等消毒因子进行消毒的方法。

（3）中水平消毒法：是可以杀灭和去除细菌芽孢以外的各种病原微生物的消毒方法，包括超声波、碘类消毒剂(碘伏、碘酊等)、醇类、醇类和氯已定的复方，醇类和季铵盐（包括双链季铵盐）类化合物的复方、酚类等消毒剂进行消毒的方法。

（4）低水平消毒法：只能杀灭细菌繁殖体（分枝杆菌除外）和亲脂病毒的化学消毒剂和通风换气、冲洗等机械除菌法。如单链季铵盐类消毒剂(苯扎溴铵等)、双胍类消毒剂如氯己定、植物类消毒剂和汞、银、铜等金属离子消毒剂等进行消毒的方法。

1.4.4.2 医用物品对人体的危险性分类

医用物品对人体的危险性是指物品污染后造成危害的程度。根据其危害程度将其分为三类：

（1）高度危险性物品：这类物品是穿过皮肤或黏膜而进入无菌的组织或器官内部的器材，或与破损的组织、皮肤、黏膜密切接触的器材和用品，例如，手术器械和用品、穿刺针、输血器材、输液器材、注射的药物和液体、透析器、血液和血液制品、导尿管、膀胱镜、腹腔镜、脏器移植物和活体组织检查钳等。

（2）中度危险性物品：这类物品仅和破损皮肤、黏膜相接触，而不进入无菌的组织内。例如，呼吸机管道、胃肠道内窥镜、气管镜、麻醉机管道、子宫帽、避孕环、压舌板、喉镜、体温表等。

（3）低度危险性物品：虽有微生物污染，但在一般情况下无害，只有当受到一定量的病原微生物污染时才造成危害的物品。这类物品和器材仅直接或间接地和健康无损的皮肤相接触，包括生活卫生用品和病人、医护人员生活和工作环境中的物品。例如，毛巾、面盆、痰盂（杯）、地面、便器、餐具、茶具、墙面、桌面、床面、被褥、一般诊断用品(听诊器、听筒、血压计袖带等)等。

1.4.4.3 微生物对消毒因子的敏感性

一般认为，微生物对消毒因子的敏感性从高到低的顺序为：

（1）亲脂病毒（有脂质膜的病毒），例如乙型肝炎病毒、流感病毒等。

（2）细菌繁殖体。

（3）真菌。

（4）亲水病毒（没有脂质包膜的病毒），例如甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等。

（5）分枝杆菌，例如结核分枝杆菌、龟分枝杆菌等。

（6）细菌芽孢，例如炭疽杆菌芽孢、枯草杆菌芽孢等。

（7）朊毒（感染性蛋白质）。

1.4.4.4 选择消毒、灭菌方法的原则

（1）使用经卫生行政部门批准的消毒药、械，并按照批准使用的范围和方法在医疗卫生机构和疫源地等消毒中使用。

（2）根据物品污染后的危害程度选择消毒、灭菌的方法。

1）高度危险性物品，必须选用灭菌方法处理。

2）中度危险性物品，一般情况下达到消毒即可，可选用中水平或高水平消毒法。但中度危险性物品的消毒要求并不相同，有些要求严格，例如内窥镜、体温表等必须达到高水平消毒，需采用高水平消毒法消毒。

3）低度危险性物品，一般可用低水平消毒方法，或只作一般的清洁处理即可，仅在特殊情况下，才作特殊的消毒要求。例如，在有病原微生物污染时，必须针对所污染病原微生物的种类选用有效的消毒方法。

（3）根据物品上污染微生物的种类、数量和危害性选择消毒、灭菌的方法

1）对受到细菌芽孢、真菌孢子、分枝杆菌和经血传播病原体（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等）污染的物品，选用高水平消毒法或灭菌法。

2）对受到真菌、亲水病毒、螺旋体、支原体、衣原体和病原微生物污染的物品，选用中水平以上的消毒方法。

3）对受到一般细菌和亲脂病毒等污染的物品，可选用中水平或低水平消毒法。

4）对存在较多有机物的物品消毒时，应加大消毒药剂的使用剂量和/或延长消毒作用时间。

5）消毒物品上微生物污染特别严重时，应加大消毒药剂的使用剂量和/或延长消毒作用时间。

（4）根据消毒物品的性质选择消毒方法

选择消毒方法时需考虑，一是要保护消毒物品不受损坏，二是使消毒方法易于发挥作用。应遵循以下基本原则：

1）耐高温、耐湿度的物品和器材，应首选压力蒸汽灭菌；耐高温的玻璃器材、油剂类和干粉类等可选用干热灭菌。

2）不耐热、不耐湿，以及贵重物品，可选择环氧乙烷或低温蒸汽甲醛气体消毒、灭菌。

3）器械的浸泡灭菌，应选择对金属基本无腐蚀性的消毒剂。

4）选择表面消毒方法，应考虑表面性质，光滑表面可选择紫外线消毒器近距离照射，或液体消毒剂擦拭；多孔材料表面可采用喷雾消毒法。

1.4.4.5 消毒、灭菌基本程序

被甲类传染病病人，以及肝炎、结核、艾滋病、炭疽病等病人的排泄物、分泌物、血液等污染的器材和物品，应先消毒再清洗，于使用前再按物品危险性的种类，选择合理的消毒、灭菌方法进行消毒或灭菌处理。普通病人用过的物品，可先清洗后消毒。

1.4.4.6 消毒工作中的个人防护

消毒因子大多对人是有害的，因此，在进行消毒时工作人员一定要有自我保护的意识和采取自我保护的措施，以防止消毒事故的发生和因消毒操作方法不当可能对人体造成的伤害。

(1) 热力灭菌：干热灭菌时应防止燃烧；压力蒸汽灭菌应防止发生爆炸事故及可能对操作人员造成的灼伤事故。

(2) 紫外线、微波消毒：应避免对人体的直接照射。

(3) 气体化学消毒剂：应防止有毒有害消毒气体的泄漏，经常检测消毒环境中该类气体的浓度，确保在国家规定的安全范围之内；对环氧乙烷气体消毒剂，还应严防发生燃烧和爆炸事故。

(4) 液体化学消毒剂：应防止过敏和可能对皮肤、黏膜的损伤。

(5) 处理锐利器械和用具应采取有效防护措施，以避免可能对人体的刺、割等伤害。

1.4.5 疫源地消毒基本要求

1.4.5.1 组织执行与人员

（1）对甲类传染病和肺炭疽、艾滋病等乙类传染病必须在当地疾病预防控制和监督机构的监督指导下，由有关单位和个人及时进行消毒处理，或由当地疾病预防控制和监督机构负责进行终末消毒。

（2）对乙类传染病中的病毒性肝炎、细菌性痢疾、伤寒和副伤寒、脊髓灰质炎、白喉、布鲁菌病、炭疽、钩端螺旋体病、流行性出血热、淋病、梅毒等和丙类传染病中肺结核，必须按照当地疾病预防控制和监督机构提出的卫生要求，由病人陪护人或所在单位进行消毒处理或由当地疾病控制机构组织进行消毒处理。

（3）对丙类传染病中的急性出血性结膜炎、感染性腹泻等由病人或其陪护人进行消毒处理。

（4）各类传染病(包括非法定传染病)爆发流行时应在当地疾病预防控制和监督机构的监督指导下，由有关单位及时进行消毒，或由当地疾病预防控制和监督负责对其进行消毒处理。

（5）在医院中对传染病病人的终末消毒由医院安排专人进行。

（6）非专业消毒人员开展疫源地消毒前应接受培训。

1.4.5.2 时限要求

接到甲类传染病疫情报告和乙类传染病中的肺炭疽和艾滋病的疫情报告后，城市应在6 h内，农村应在12 h内采取消毒措施，其他传染病按病种不同应在24h至48h内采取消毒措施。

1.4.5.3 装备要求

承担疫源地消毒任务的单位，应根据工作需要和条件配备消毒工具和防护用品，储备一定数量的消毒剂。

(1)消毒工具：背负式喷雾器、气溶胶喷雾器、机动喷雾器、配药桶（10L）、刻度量杯（筒）、工具箱、消毒车。

(2)防护用品：工作服、隔离服、防护眼镜、口罩、防鼠疫口罩、帽子、手套、长筒胶靴、毛巾、污物袋、手电筒、皮卷尺、雨衣、长柄毛刷、装工作衣的布袋（750px×750px×1000px）、肥皂盒、皮肤消毒盒（瓶）。

(3)消毒剂：储备一定量的消毒剂并与有关厂家建立联系，确保处理突发疫情的需要。常用消毒剂有过氧乙酸、含氯消毒剂、碘伏等。

1.4.5.4 技术要求 

(1)疫区消毒

1)消毒范围和对象：以传染源排出病原体可能污染的范围为依据确定消毒范围和对象。

2)消毒持续时间：以传染病流行情况和病原体监测结果为依据确定消毒的持续时间。

3)消毒方法的选择：以消毒因子的性能、消毒对象、病原体种类为依据选择消毒方法。尽量避免破坏消毒对象的使用价值和造成环境的污染。

4)疑似传染病疫源地的消毒：可按疑似的该类传染病疫源地进行消毒处理或按下一条进行处理。

5)不明传染病疫源地的消毒：应根据流行病学指征确定消毒范围和对象，采取最严格的消毒方法进行处理。

6)注意与其它传染病控制措施配合：搞好传染源的管理，疫区的封锁、隔离，杀蝇、防蝇，灭鼠、防鼠，灭蚤，搞好饮用水、污水、食品的消毒及卫生管理，搞好环境卫生。加强易感人群的保护。

7)填报消毒工作记录，必要时进行消毒效果评价。

(2)疫点的随时消毒

1)对病人应根据病情做到“三分开”与“六消毒”。“三分开”是指：①分住室（条件不具备可用布帘隔开，至少要分床）；②分饮食；③分生活用具（包括餐具、洗漱用具、便盆、痰罐等）。“六消毒”是指：①消毒分泌或排泄物（如呼吸道传染病主要为口鼻分泌物，肠道传染病主要为粪便，接触性传染病主要为脓液、痂皮等）；②消毒生活用具；③消毒双手；④消毒衣服、被单；⑤消毒患者居室；⑥消毒生活污水、污物。

2)病人陪伴和护理人员，除做好病人的随时消毒外，应做好本人的卫生防护，护理病人后，应消毒双手。

(3)疫点的终末消毒程序

1)在出发前，应检查所需消毒用具、消毒剂和防护用品，做好准备工作。

2)消毒人员到达疫点，首先查对门牌号和病人姓名，并向有关人员说明来意，做好防疫知识宣传，禁止无关人员进入消毒区域内。

3)对脱掉外衣应放在自带的布袋中（不要放在污染或可能受到污染的地方）。穿隔离服、胶鞋，戴上口罩、帽子。用过氧乙酸或含氯制剂时，须戴防护眼镜。

4)仔细了解病员患病前和患病期间居住的房间、活动场所，用过的物品、家具，吐泻物、污染物倾倒或存放地点，以及污水排放处等，据此确定消毒范围和消毒对象。根据消毒对象及其污染情况，选择适宜的消毒方法。

5)进入疫点时，应先消毒有关通道。

6)测量房屋、家具及地面需消毒的面积和体积，估算需消毒的污水量。

7)必要时，由检验人员对不同消毒对象进行消毒前采样。

8)消毒前应关闭门窗，将水缸盖好，将未被污染的贵重衣物、饮食类物品、名贵字画及陈列物品收藏好。

9)如系呼吸道传染病，应对室内空气进行消毒。

10)如系肠道传染病，应先于室内灭蝇，再进行消毒。

11)对室内地面、墙壁、家具和陈设物品消毒时，应按照先上后下，先左后右的方法，依次进行消毒。

12)病人用过的餐（饮）具、污染的衣物若不能集中在消毒站消毒时，可在疫点进行煮沸、浸泡或擦拭消毒。 作浸泡消毒时，必须使消毒液浸透被消毒物品。作擦拭消毒时，必须反复擦拭2次～3次。对污染重、经济价值不大的物品和废弃物，在征得病家同意后焚烧。

13)室内消毒后，必要时对厕所、垃圾、下水道口、自来水龙头、缸水和井水等进行消毒。

14)对传染源密切接触者进行人员卫生处理。

15)疫点消毒工作完毕，对消毒人员穿着的工作服、胶靴等进行喷洒消毒后脱下。将衣物污染面向内卷在一起，放在布袋中带回消毒。所用消毒工具表面用消毒剂进行擦洗消毒。

16)必要时，到达规定的消毒作用时间后，由检验人员对不同消毒对象进行消毒后采样。

17)填写疫点终末消毒工作记录。

18)离开病家前，让病家开窗通风，擦拭打扫。

(4)消毒人员注意事项

1）出发前，要检查应携带的消毒工具是否齐全无故障，消毒剂是否足够。

2）应主动取得病家合作和相关人员的配合。选择消毒因子时，应尽量采用物理法消毒。在用化学法消毒时应尽量选择对相应致病微生物杀灭作用良好，对人、畜安全，对物品损害轻微，对环境影响小的消毒剂。

3）消毒过程中，不得吸烟、饮食。要注意自我保护，既要防止或减少受到消毒因子的伤害又要避免受到微生物感染。

4)消毒过程中，不得随便走出消毒区域，禁止无关人员进入消毒区内。

5)消毒应有条不紊，突出重点。凡应消毒的物品，不得遗漏。严格区分已消毒和未消毒的物品，勿使已消毒的物品被再次污染。

6)携回的污染衣物应立即分类作最终消毒。

7)清点所消耗的药品器材，加以整修、补充。

8)填好的消毒记录应及时上报。

2.1消毒产品消毒效果检验技术规范

2.1.1 消毒剂杀微生物试验

2.1.1.1 适用范围

主要适用于消毒剂鉴定和日常监测，用来评价各种用途的消毒剂对微生物的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒剂的杀菌能力的重要方面进行验证，侧重反映消毒剂的实用剂量与杀菌能力。不能反映消毒剂的全面特性。

2.1.1.2 菌悬液与菌片的制备

2.1.1.2.1 适用范围

制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。

2.1.1.2.2 试验器材

（1）菌种:金黄色葡萄球菌ATCC 6538、铜绿假单胞菌ATCC 15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC 9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。

（2）有机干扰物：见附录A。

（3）磷酸盐缓冲液：见附录A。

（4）无菌蒸馏水。

（5）稀释液：见附录A。

（6）细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录A。

（7）革兰染色液：见附录A。

（8）芽孢染色液：见附录A。

（9）恒温水浴箱。

（10）玻璃漏斗。

（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。

（12）数字可调移液器（10μl， 20μl， 100μl，200μl，1000μl）及配套用一次性塑料吸头。

（13）离心机。

（14）电动混合器

（15）浊度计。

2.1.1.2.3 细菌悬液制备程序

（1）细菌繁殖体悬液的制备

1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养 18h～24h。挑取上述第2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。

（2）稀释度间误差率计算公式：

2.1.1.3.5 注意事项

（1）严格无菌操作，防止污染。

（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。

（3）注意菌液的均匀分散。

（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。

（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。

（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。

（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过45℃，以防损伤细菌或真菌。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。

（8）为提高试验成功率，最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在首次试验时所取的有限稀释范围内（2个～3个 稀释度）即有长菌在 15cfu～300cfu 之间的平板。

（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。

2.1.1.4 残留消毒剂的去除方法

2.1.1.4.1  目  的

在化学消毒试验中，达到规定消毒时间终点时，要求立即终止残留消毒剂的继续作用，以便准确检测出消毒体系中残留存活的微生物及其数量。因为消毒体系中残留的消毒剂，可能对微生物的生长繁殖具有一定抑制作用，从而可导致对杀菌效果偏高的错误判断，甚至产生假阴性结果。残留消毒剂的去除（下简称除药），可排除残留消毒剂对微生物的抑制，从而使试验获得正确结果。

2.1.1.4.2 除药的原则

（1）可有效去除残留的消毒剂。

（2）对微生物无害，不减少微生物应有的回收量。

（3）不破坏培养基的营养成份，不影响其透明度。

（4）必须按规定方法进行鉴定试验，并认为合格者方可在相应的消毒试验中使用。

2.1.1.4.3 除药的方法

（1）化学中和法：又称中和剂法，是指在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。本法同时含有稀释作用效果（至少1:1稀释，常用1:10稀释），是最为普遍使用的方法。

对常用消毒剂，虽有一些中和剂介绍，但在实际应用中由于情况多变，效果不一定都理想。所以，在消毒试验前仍应将拟用中和剂按试验具体情况，经鉴定合格后再使用。

操作要点：①对接触消毒剂的微生物样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中；②所用中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同；③即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；④在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。

（2）过滤冲洗法

将经消毒剂作用过的微生物样本，立即加入适量稀释液中混匀（通过适量稀释，可减轻消毒剂的持续作用），并倾入装有微孔滤膜的滤器内，接真空泵抽吸过滤（或加压过滤）后，再加适量稀释液冲洗，同时过滤，可去除残留的消毒剂。多用于难以找到适宜中和剂的消毒剂试验中，如以植物提取物制备的消毒剂。本除药方法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。

操作要点：①准备好装有相应孔径微孔滤膜的滤器；②滤膜及滤器需先经灭菌处理；③初次过滤后，应使用一定量对微生物无害的稀释液进行冲洗，冲洗次数一般以洗净消毒剂为准；④最后一次冲洗、滤净后，将微孔滤膜以无菌操作法取出，进行随后的培养检测。

（3）稀释法

将经消毒剂作用过的微生物样本，用稀释液稀释，降低残留消毒剂浓度，以消除对微生物的抑制作用。但若稀释过多，微生物浓度下降，可出现假阴性结果。本法可单独使用，但更常见的是与其它方法同时使用。单独使用时，一般多用于浓度系数较高的消毒剂（如醇类消毒剂）。本法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。

操作要点：①对接触消毒剂的微生物样本，在达到规定作用时间后，即时以对微生物无害的稀释液稀释，稀释比例随试验需要决定；②电动混合或敲打振荡，使之混匀；③吸取稀释样液进行随后培养检测。

2.1.1.4.4 注意事项

（1）处理时应严守无菌操作要求，所有试液须无菌，接触样本和试液的器材（如吸管、平皿、试管、滤材等）亦均须经灭菌，以免污染样本，影响试验结果。

（2）每次吸液，均须更换一支无菌吸管，以防交叉污染。此点由于操作繁琐，器材需求量大，往往不能认真执行，应加以注意。

（3）为保证试验的准确性，所用吸管的容量应尽量与拟吸取的液体量相近，不要用大吸管吸取少量液体；试验样本的混匀操作，必须认真进行；尽量减少中和剂或中和产物与试验微生物的接触时间。

（4）所用方法适宜与否，和消毒剂性质、复方中的附加成份、试验微生物种类、消毒试验种类等等均有关系，试验条件稍有改变就可能影响除药效果。故每进行一种消毒试验（包括消毒剂或微生物的更换），均需按规定对所选方法进行鉴定试验，合格者方可用于正式试验。此步骤绝不可省略，否则极有可能导致试验产生错误结果。

2.1.1.5 中和剂鉴定试验

2.1.1.5.1 目 的

确定所选中和剂是否适用于拟进行的细菌和真菌杀灭试验。

2.1.1.5.2 试验器材

（1）试验菌菌悬液和菌片（见 2.1.1.2）。

（2）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。

（3）小平皿（4 cm～150px 直径）。

（4）恒温水浴箱。

（5）稀释液：见附录A。

（6）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。

（7）电动混合器

2.1.1.5.3 试验设计原则

（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用，对试验用细菌以及其恢复期培养是否有害或不良影响。

（2）在确定用何种中和剂进行鉴定试验有困难时，可对多个中和剂进行初选以确定（见本款文后【附】）。

（3）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低，则不足以显示能否将高浓度消毒剂全部中和。

（4）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒剂组（第2组）无菌生长，不能表明中和后受到消毒剂作用后的细菌是否能恢复生长。细菌是否复苏。此时可适当缩短作用时间重新进行试验，但作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。若缩短作用时间后仍无菌生长，在排除其他原因的基础上，可适当下调杀菌试验中消毒剂浓度，再次进行中和剂鉴定试验。

（5）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，应按微生物种类分别进行鉴定试验。对细菌繁殖体，在大肠杆菌（8099）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。

当用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验。

（6）鉴定时根据所用杀菌试验方法，使用相应的悬液或载体定量试验。

【附】中和剂初选试验

中和剂鉴定试验前，若难确定拟检测的中和剂，可通过本试验初选，而后以选中的中和剂进行正式的鉴定试验。初选操作程序如下：

（1）将0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×103 cfu/ml～3×103 cfu/ml）加入含 4.5ml 中和剂试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。

（2）将0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×103 cfu/ml～3×103 cfu/ml）加入含 4.5ml中和产物试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。

（3）试验同时设阳性对照组。阳性对照组以 0.5ml 菌悬液加入含 4.5ml 稀释液试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用TSA倾注法培养。

当3组平板上长出的菌落数接近，如果以阳性对照组为标准（X），前两组长菌数为（X±50%X）以内，可进行正式的鉴定试验。

2.1.1.5.4 试验分组

第1组  消毒剂 + 菌悬液 →培养

观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。

第2组  （消毒剂 + 菌悬液） + 中和剂 → 培养

观察残留消毒剂被中和后受到清毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。

第3组  中和剂 + 菌悬液 → 培养

观察中和剂是否抑菌。

第4组  （消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培养

观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。

第5组  稀释液 + 菌悬液 → 培养

作为菌数对照。

第6组  稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养

作为阴性对照。

2.1.1.5.5 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序 

根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。将消毒剂按所需浓度配制好后，置20℃±1℃水浴中待用。

按2.1.1.2制备试验菌悬液。取2.0ml试验菌悬液于试管中，加入2.0ml有机干扰物质，制成含有机干扰物质的菌悬液，置20℃±1℃水浴中备用。

（1）第 1 组。吸取1.0ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml消毒剂于试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含有 4.5ml 稀释液的试管中，混匀。吸取该最终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。

（2）第2组。吸取1.0ml含有机干扰物质试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml消毒剂于试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含 4.5ml 中和剂溶液管中，混匀，作用10min。吸取该最终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。

如平板生长菌落数均超过 300 个，应以稀释液对上述最终样液作适宜稀释后，再次进行活菌培养计数。

（3）第 3 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，加入0.4ml硬水，混匀。加入4.5ml中和剂，作用10min。用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（4）第 4 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，吸加4.9ml中和产物溶液（以0.4ml消毒剂加4.5ml中和剂，作用 10min 配制而成）于试管内，混匀。作用10min，吸取该最终样液 0.5ml，用中和产物溶液做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（5）第5组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃ 水浴中5min 后，吸加0.4ml硬水于试管内，混匀。加入4.5ml稀释液，作用 10min ，用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（6）第 6 组。分别吸取稀释液、中和剂和硬水各1.0ml于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基25ml，培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。

2.1.1.5.6  中和剂载体定量鉴定试验操作程序

根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。

（1）第1组。吸取消毒剂5.0ml于无菌小平皿内，将其置20℃±1℃水浴中5min后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至试验预定的时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0ml稀释液试管中，作用10min。用电动混合器混合20s，或将试管振打80次，吸取该最终样液 1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。

（2）第 2 组。吸取消毒剂 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中，待作用至试验预定时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打80 次。作用10min，吸取该最终样液1.0ml，分别接种于各平皿中，做活菌培养计数。

如平板生长菌落数均超过 300个， 应重新吸取该最终样液 0.5ml，用稀释液做适当稀释，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（3）第 3 组。吸取中和剂 5.0ml 于无菌小平皿中，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和剂内，作用 10min。立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0 ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打80 次，混匀。吸取该最终样液 1.0ml，用中和剂做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（4）第 4 组。 吸取中和产物溶液 （以一片浸有消毒剂的载体置 5.0ml 中和剂内，作用10min） 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和产物溶液中。作用 10min，用无菌镊子取出菌片，移入含 5.0ml 中和产物溶液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液0.5ml，用中和产物溶液做10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（5）第 5 组。吸取稀释液 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后， 用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于稀释液中。作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 稀释液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液0.5ml，用稀释液 做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

（6）第 6 组。分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。如出现细菌生长，提示试验材料或操作过程中可能有污染。应重新进行试验。

2.1.1.5.7  评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:

（1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数试验菌菌落生长。

（2） 第 2 组有较第 1 组为多，但较第 3、4、5（组）为少的试验菌菌落生长，并符合表 2-1 要求者。

表 2-1  中和剂鉴定试验合格标准中对第 1 组与第 2 组菌落数的要求

注：对抑菌作用不明显消毒剂（如乙醇）所用中和剂的鉴定试验中，当第 1 组与第 2 组菌落数相近，难以达到本表要求时，可根据具体情况另行作出判断和评价。

（3） 第 3、4、5（组）有相似量试验菌生长，悬液试验在1×107 cfu/ml～5×107 cfu/ml之间，载体试验在 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片 之间。其组间菌落数误差率应不超过 15%。第3、4、5 组间菌落数误差率计算公式其计算公式如下。

（4）第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应更换无污染的试剂重新进行试验。

（5）连续 3 次试验取得合格评价。

2.1.1.5.8  注意事项

（1）试验所分各组均有其特定意义，不得任意删减。

（2）严守无菌操作，保持试液和器材的无菌，注意更换吸管，以防止沾染影响试验的准确性。

（3）在计算微生物浓度时，须考虑其稀释倍数。

（4）试验组序应按本规范所列排列。

2.1.1.6 物理法去除残留消毒剂试验

2.1.1.6.1 目 的

通过本鉴定试验，确定常用的物理去除法是否可去除消毒体系中残留的消毒剂，使消毒剂鉴定试验显示出真正的杀菌效果。

2.1.1.6.2 试验器材

（1）过滤冲洗法需用经过灭菌处理的滤器、微孔滤膜、真空泵（或抽滤泵）。

（2）离心沉淀法需用离心机与离心管。

（3）吸附柱、分子筛柱（主要供病毒灭活试验用）。

（4）无菌稀释液、冲洗液。要求不应影响除药材料（如滤膜、吸附柱等）的性质，对微生物无伤害作用。常用的有：水、缓冲液（如PBS）、稀释液、含0.1%～0.5%吐温80的PBS、中和剂（可中和部分消毒成分）。

（5）其他器材随所用试验微生物而定。

2.1.1.6.3 试验设计原则

（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所选方法是否对测试消毒剂有良好的去除作用，对试验用微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响。

（2）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低不足以显示能否将高浓度消毒剂全部去除。

（3）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒剂组无微生物生长，不能表明去除处理后细菌是否复苏。此时可增加处理时间或次数，亦可适当缩短作用时间再试。作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。

（4）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用物理去除消毒剂法应按微生物种类分别进行鉴定试验，不得互相取代。对细菌繁殖体的试验，可在大肠杆菌（8099）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442）或金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。

当用其他特定微生物 （如龟分枝杆菌脓肿亚种） 进行杀灭试验时，均应以该特定微生物再次进行去除消毒剂方法的鉴定试验。

（5）鉴定中应根据正式杀灭试验的设计，选择使用悬液定量试验，还是载体定量试验。通常，悬液鉴定试验结果可用于载体试验。

2.1.1.6.4  物理去除方法的鉴定

（1）分组方法如下：

1）消毒剂 + 菌悬液 → 培养

观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制作用。

2）（菌悬液 + 消毒剂） + 过滤冲洗法处理 → 培养

观察所用去除消毒剂处理后，受到消毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。

3）（菌悬液 + 水） ＋过滤冲洗法处理 → 培养

观察去除消毒剂处理是否影响试验菌的生长数量。

4）菌悬液 → 培养

作为菌悬液阳性对照值。

（2）操作程序如下：

1） 第 1 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml消毒剂（应先置 20℃±1℃中水浴）于试管内，混匀，作用至试验预定时间。吸取该最终样液0.5ml，加于含4.5ml 稀释液试管中，混匀。吸取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数。

2） 第 2 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml消毒剂于试管中，混匀。作用至试验预定时间，对其进行去除消毒剂处理，并取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。如平皿生长菌落数均超过300 个，应再吸取该最终样液 0.5ml，用 PBS 做适当稀释，选择适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数。

3） 第 3 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml硬水于试管内，混匀。不加消毒剂，做同上处理。取最终样液 0.5 ml 用稀释液做 10 倍系列稀释，选择 2个～3个适宜稀释度悬液，各取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可先进行10 倍系列稀释，再经过滤冲洗法处理，然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。

4） 第 4 组。吸取试验菌悬液 1.0ml，置含 4.0 ml 稀释液的试管中，不加消毒剂，亦不作任何去除处理，进行活菌培养计数，作为阳性对照值。

（3） 评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:

1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数生长。

2） 第 2 组有远较第 1 组为多，但较第 3、4（组）为少的试验菌生长。在第 1 组无菌生长时，第 2 组平均每个平板 （或滤膜） 上生长菌落不少于 5 个。

3） 第 3、4 （组）测定的结果，微生物数量应在 1×107 cfu/ml～5×107 cfu/ml 之间，其组间差不得超过两组回收菌数平均值的50%。组间差的计算可按下式进行:

4）连续 3 次试验取得合格评价。

5）本规范推荐使用过滤冲洗法。

2.1.1.6.5 注意事项  见 2.1.1.5.8。

2.1.1.7 细菌定量杀灭试验

2.1.1.7.1 目 的

在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢所需剂量，以验证实用消毒剂量。

2.1.1.7.2 试验器材

（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。此外，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，准备其他菌种的悬液或菌片。

（2）消毒剂溶液除有特殊规定者外，应使用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如，含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准，碘伏以所含有效碘为准，过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准，复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分含量为准。各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算，应以试验菌与消毒剂的混合液中有效成份的最终浓度为准。

（3）去除残留消毒剂的中和剂或设备 （经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材）。

（4）消毒剂稀释用硬水：见附录A。

（5）有机干扰物质。悬液试验用3%BSA溶液，载体试验直接用TSB(见附录A)。

（6）TSA培养基：见附录A。

（7）含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（中和剂TSB），中和剂经鉴定合格。

（8）刻度吸管 （1.0ml、5.0ml）。

（9）恒温水浴箱。

（10）喷雾器（用于喷雾消毒试验）。

（11）电动混合器。

（12）秒表。

2.1.1.7.3 试验分组

试验中应分以下各组：

（1）试验组。按测试目的有两种选择。

第一种适用于消毒产品鉴定。根据本规范中表1-1和使用说明书，选定试验菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及3个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的0.5倍，指定最低作用时间的1.5倍。如说明书指定最短作用时间为20min，则应进行10min、20min、30min 三个时间）进行试验。

第二种适用于消毒产品监督机构日常监测。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及一个作用时间（说明书指定最短作用时间）进行试验。

（2）阳性对照组。根据各种试验的规定，用稀释液代替消毒剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表菌液原有浓度，以其作为计算杀灭对数的初始浓度。

2.1.1.7.4 悬液定量杀菌试验操作程序

（1）首先按产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200mg/L，则应配制250mg/L），置20℃±1℃ 水浴备用。

（2）按照2.1.1.2 配制实验用菌悬液，浓度为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml。

（3）取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。

（4）待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取0.5ml试验菌与消毒剂混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。

（5）各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2 个平皿即可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。

（6）同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。

（7）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

（8）试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值:

杀灭对数值 (KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度对数值（Nx）

计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。

2.1.1.7.5 载体浸泡杀菌试验操作程序

（1）载体浸泡定量杀菌试验操作程序

1）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。

2）将盛有消毒剂平皿置 20℃±1℃ 水浴箱内 5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。

3）待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。最终进一步混匀后，吸取 1.0ml 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，测定存活菌数。

4）另取一平皿，注入 10.0ml 稀释液代替消毒液，放入 2 片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。

5）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

6）试验重复 3 次 （包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按2.1.1.7.4（8）公式计算杀灭对数值。

（2）载体浸泡定性灭菌试验操作程序

1）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片5.0ml的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。

2）将盛有消毒剂平皿置20℃±1℃水浴箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片6片，（每个作用时间2片菌片）并使之浸透于消毒液中。

3）待试验菌与消毒液相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含5.0ml中和剂TSB试管中。用电动混合器混合20s，作为试验组样本。

4）另取一平皿，注入20.0ml硬水代替消毒液，放入4片菌片，作用至预定时间，取出2片，分别移入含5ml中和剂TSB试管中。其随后的试验步骤与上述试验组相同，作为阳性对照组样本。另取出2片，分别移入一含5.0ml中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲80次，然后用稀释液做10倍系列稀释，选择适宜稀释度，吸取1.0ml接种平皿，每管接种2个平皿，做活菌培养计数，作为菌数对照组样本。

5）所有试验样本均在37℃温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h，观察最终结果；对细菌芽孢需培养7d，观察最终结果。

6）试验重复5次（包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片）。

2.1.1.7.6 载体喷雾定量杀菌试验操作程序

（1）根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定1个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）和 3 个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的0.5倍，指定最低作用时间的1.5倍。如说明书指定最短作用时间为20min，则应进行10min、20min、30min 三个时间）进行试验。

（2）选定消毒剂的浓度与作用时间。每种菌所染菌片应分开进行试验。试验时，每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。

（3）每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。

（4）待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间，取每种载体菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。

（5）吸取 1.0ml 上述洗液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管接种 2 个平皿。

（6）每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。喷雾器换装新浓度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。

（7）用硬水代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，作为阳性对照组。如为压力罐装自动喷雾式气雾消毒剂，可直接用染菌载体作活菌计数，作为处理前阳性对照组。

（8）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

（9）试验重复 3 次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按2.1.1.7.4（8）公式计算杀灭对数值。

2.1.1.7.7 定量杀菌试验的评价规定

（1）产品监督检验，在产品说明书指定的最低浓度与最低作用时间，重复试验3次。要求悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，可判定为消毒合格。要求载体定量杀灭试验，各次的杀灭对数值均≥3.00，可判定消毒合格。

（2）产品申报卫生许可检验中，要求在产品说明书指定的浓度与3作用时间，重复试验3次。在产品指定最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均应≥5.00。要求载体定量杀灭试验中，各次的杀灭对数均应≥3.00，可判定为消毒合格。在产品指定浓度与最短作用时间的0.5倍时，可容许对不同细菌或在部分重复次数中，出现不合格结果。

（3）对载体浸泡定性灭菌试验，阳性对照组应有菌生长，菌数对照组符合要求，阴性对照组应无菌生长，5次试验所有作用时间均无菌生长为灭菌合格。

（4）报告中应将各此试验的结果全部以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次试验菌浓度，以及平均试验菌浓度。试验组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。

2.1.1.7.8 注意事项

（1）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。

（2）试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。

（3）悬液定量杀菌试验时，有机干扰物质一般采用3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。如果某消毒剂使用说明书中指定，其产品只用于清洁物品或器械的消毒或只清洗消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。

2.1.1.8杀灭分枝杆菌试验

2.1.1.8.1 目的  

在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上分枝杆菌所需剂量，以验证对分枝杆菌（包括结核杆菌）实用消毒剂量。

2.1.1.8.2 试验器材

(1) 试验菌株 龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326。

(2) 培养基 分枝杆菌干燥培养基(上海奥普生物医药有限公司)。

(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备。

(4) 中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。

(5) 稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液。

(6) 消毒剂稀释用硬水：见附录A。

(7) 有机干扰物质：见附录A。

(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。

(9) 恒温水浴箱。

(10) 喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。

(11) 电力混合器。

(12) 计时装置。

(13) 恒温培养箱。

2.1.1.8.3 龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326 菌悬液的制备

（1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0mlMADC肉汤或罗氏肉汤试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基平板上，于 37℃ 培养 72h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，于 37℃ 培养 72h，即为第3代培养物。密封后，在4℃保存，时间不得超过6周。

（2）试验时取第3代斜面培养物，在分枝杆菌琼脂斜面上连续传代，培养方法与第3代相同。取第5代～6代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物（72h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至一含有6-7g玻璃珠的无菌圆锥底试管中，在电动混合器混合至少5min。然后将菌液吸入到另一试管内制成菌悬液。

（3）将制成的菌悬液，进行活菌培养计数（见 2.1.1.3），按其结果用稀释液稀释至所需浓度。

（4）菌悬液保存在4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。

2.1.1.8.4 试验分组

试验分为下列各组:

(1) 试验组，按 2.1.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间。

(2) 阳性对照组， 以硬水代替消毒剂溶液，按 2.1.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对受试菌的杀灭对数值。

(3) 阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。

2.1.1.8.5 试验程序

常用杀灭试验有: 悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀菌试验等。其操作程序详见 2.1.1.7.4，2.1.1.7.5，2.1.1.7.6。接种后的平皿应放入干净的塑料袋内，在37℃中培养1周，观察最终结果。

2.1.1.8.6 评价规定

(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均 ≥4.00 ，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均≥3.00，可判定该产品对分枝杆菌污染物消毒合格。

(2)产品鉴定检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，可判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。

用载体浸泡定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品使用说明书规定的使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，可判为试验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。

2.1.1.9 真菌杀灭试验

2.1.1.9.1 目的

在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子所需剂量，以验证对真菌及其孢子实用消毒剂量。

2.1.1.9.2试验器材

(1) 麦芽浸膏琼脂（MEA）：见附录A。

(2) 沙堡琼脂培养基：见附录A。

(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备

白色念珠菌ATCC 10231 和黑曲霉菌ATCC 16404 或孢子悬液与菌片按 2.1.1.9.3(1) 和 2.1.1.9.3(2) 所示方法制备。

此外，根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选用其它真菌或孢子悬液与菌片。

（4）中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。

（5）磷酸盐缓冲液( PBS， 0.03 mol/L，pH7.2)。

（6）消毒剂稀释用硬水：见附录A。

（7）有机干扰物质：见附录A。

（8）刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。

（9）恒温水浴箱。

（10）喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。

（11）电动混合器。

（12）计时装置。

2.1.1.9.3 真菌悬液制备

（1）白色念珠菌悬液的制备

1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。将其密封后在4℃保存，时间不得超过6周。

2）试验时，取第3代斜面培养物在砂堡琼脂斜面上连续传代，方法与第3代相同。取第5代或6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。

3）悬液杀菌试验时，实验用菌悬液的含菌量为1×107cfu/ml～5×107cfu/ml；菌片制备按2.1.1.2 要求进行。

4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。

5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。

（2）黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。

1) 取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细管吸取少量麦芽浸膏肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含5.0ml麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。用接种环划线接种第1代培养物于MEA培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h。取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养琼脂斜面培养基，置 30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h，即为第3代培养物。将其密封后在4℃保存，时间不得超过9周。

2) 试验时，取第3代斜面培养物接种麦芽浸膏琼脂斜面，30℃培养48h，取得3.0~5.0ml麦芽浸膏肉汤，洗下斜面上的培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 MEA 培养基表面，然后吸弃多余肉汤培养物液体，置 30℃±1℃ 培养 7d～9d。

3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐温 80 生理盐水溶液，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇 1min 后，滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min～6000 r/min，离心 20min。再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。

4) 黑曲霉分生孢子悬液在 2℃～8℃ 储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。

5) 使用时，可用稀释液适当稀释。悬液试验时实验用菌悬液的含菌量为1×107 cfu/ml～5×107 cfu/ml。

6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10μl。染菌后，置 37℃ 培养箱内干燥(约 30min)，或置室温下自然阴干后再使用。

7) 回收菌数应达5×105cfu/片～5×106cfu/片，可依试验要求确定。

2.1.1.9.4  试验分组

试验分为下列各组:

(1) 试验组，按2.1.1.7.3规定，选定消毒剂浓度与作用时间，对受试菌种的杀灭能力进行测定。

(2) 阳性对照组，以硬水代替消毒剂溶液，按2.1.1.7.3规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含试验菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值。

(3) 阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。

2.1.1.9.5  试验程序

常用杀灭试验有：悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验、载体喷雾定量杀菌试验等。培养基对白色念珠菌为沙堡葡萄糖琼脂，对黑曲霉菌为麦芽浸膏琼脂（MEA）。其操作程序详见 2.1.1.7。

活菌培养计数时，对白色念珠菌，在37℃培养箱中培养48h 观察最终结果。对黑曲霉菌，在30℃培养箱中培养72h观察最终结果。

2.1.1.9.6 评价规定

(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均≥4.00，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均≥3.00，可判定该产品对真菌污染物消毒合格。

(2) 产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最低作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。

用载体浸泡定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。

2.1.1.9.7 注意事项

(1) 黑曲霉菌试验操作应在 Ⅱ 级生物安全柜内进行，避免造成环境污染和操作者受污染。

(2) 其它注意事项见 2.1.1.7.8。

2.1.1.10  病毒灭活试验

2.1.1.10.1 适用范围

主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技

术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。

2.1.1.10.2 试验器材

（1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（HIV-1）美国株。

（2）宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T 淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。

（3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。

（4）恒温水浴箱。

（5）二氧化碳培养箱。

（6）层流超净工作台。

（7）低温冰箱（-20℃，-80℃）。

（8）液氮罐。

（9）倒置显微镜。

（10）离心机。

（11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。

（12）细胞维持培养基：见附录A。

（13）细胞完全培养基：见附录A。

（14）去离子水。

2.1.1.10.3 病毒悬液的制备

（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。

（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。

（3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中。

（4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。

2.1.1.10.4 病毒灭活滴度计算方法

（1）终点稀释法病毒感染滴度的计算

以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。TCID50的对数值计算公式如下。

TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例

（“病变率高于 50% 组”是指病变率超过50%的最低组，下简称“高于 50% 组”；“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的最高组，下简称“低于50%组”）。

具体计算方法如下：

1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积〔见表 2-2〕。

各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）〔见表 2-2〕。

2）计算距离比例。距离比例可按下式计算：

3）计算举例

设试验数据如表 2-2 

表 2-2  某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果

本例，高于 50% 组病变率（%）为80；低于50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度对数值为6。

TCID50 对数值 = 6＋0.5 = 6.5

（2）噬斑法病毒感染滴度的计算

噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（pfu），简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术（参见2.1.1.3）。

每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）＝ 平板平均噬斑数×稀释倍数

（3）平均灭活对数值的计算

平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。

平均灭活对数值 = log No－log Nx

2.1.1.10.5  残留消毒剂化学中和法的鉴定试验

（1）目  的

本鉴定试验只在确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。

（2）试验设计原则

1） 通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒药物有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响。

2） 根据试验目的，选择适宜的病毒株和细胞株。

3） 中和试验用药物浓度应为正式消毒试验最高浓度。作用时间最短不得少于30s。

（3）试验分组

在使用细胞感染法进行病毒灭活试验时，对所用中和剂的鉴定，应进行以下各组试验。其中，先进行预备试验中的第 1组～3 组试验，如中和剂与中和产物对细胞生长无影响，再进行以下的正式试验。

预备试验:

1）中和剂 + 细胞 → 培养

观察所用中和剂对细胞的生长有无影响。

2）（消毒剂 + 中和剂）+ 细胞 → 培养

观察中和产物溶液对细胞生长有无影响。

3）（消毒剂 + 细胞）→培养

观察消毒剂对细胞生长有无影响。

正式试验:

1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养

观察所试消毒剂对病毒有无抑制或灭活作用。

2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 中和剂 → 接种细胞培养

观察残留消毒剂被去除后，病毒是否可恢复对细胞的感染作用。

3）中和剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养

观察中和剂对病毒有无抑制作用。

4）（消毒剂 + 中和剂） + 病毒悬液 → 接种细胞培养

观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。

5）病毒悬液 → 接种细胞培养

观察病毒是否可正常生长，并将其结果作为阳性对照值。

6）未接种病毒的细胞 → 培养

观察其生长是否正常。

（4）病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序

根据试验分组，准备足量有关器材，依次摆放，进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。各组每吸一次试剂或样本，即应更换一次吸管或微量移液器吸头，以防相互污染。

1）预备试验第 1 组。 将试验用细胞，分别加入不同稀释度的中和剂溶液，作用3 h～4h 后，吸去液体，另加细胞维持培养液，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。

2）预备试验第 2 组。将试验用细胞， 分别加入不同稀释度中和产物溶液作用3h～4h 后，吸去中和产物溶液，另加细胞基础培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。

3）预备试验第 3 组。将试验用细胞，分别加入不同稀释度的消毒剂，作用 3h～4h后，吸去消毒剂，另加细胞维持培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。

4）正式试验第 1 组。吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验预定的灭活病毒时间，加入1.0ml去离子水，根据试验规定量，吸取该最终样液 （或以对病毒无害的稀释液作系列稀释），进行随后的病毒滴度测定。

5）正式试验第 2 组。吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加 0.5ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，加入 1.0ml 中和剂溶液，混匀，作用 10min。进行随后的病毒滴度测定。

6）正式试验第 3 组。吸取 0.5 ml 去离子水于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用10 min，加入 1.0 ml 中和剂溶液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。

7）正式试验第 4 组。吸取双倍浓度消毒剂 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，加入 1.0ml 中和剂，再吸加 0.5ml病毒悬液，混匀，作用 10min。进行随后的病毒滴度测定。

8）正式试验第 5 组。吸取去离子水 1.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。

9）正式试验第 6 组。将试验用细胞，加细胞维持培养液后，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。

10）本试验中对各种病毒的接种和检测操作技术，若无特殊要求，按病毒学中各种病毒的常规培养和检测方法进行即可。

（5）评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:

1）正式试验中第 1 组无试验病毒，或仅有少量试验病毒生长。

2）正式试验中第 2 组有较第 1 组显著为多，但较第 3、4、5（组）显著为少的试验病毒生长。

3）正式试验中第 3、4、5（组）病毒生长与原接种量相近。

4）正式试验中第 6 组细胞生长正常。

5）预备试验结果显示，中和剂和中和产物，在正式试验的最高浓度下对细胞生长无影响。

6）连续 3 次试验取得合格评价。

（6）注意事项

病毒载体中和试验法可参照上述悬液定量中和试验程序，并按照病毒学原理进行适当修改后使用。

2.1.1.10.6 残留消毒剂物理去除方法的鉴定试验

病毒灭活试验中的物理除药法，首先稀释法，其次为吸附柱法、分子筛柱法、载体冲洗法。

（1）分 组

1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种培养

观察所试消毒剂对病毒有无灭活或抑制作用，对细胞正常生长有无影响。

2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 除药处理 → 接种培养

观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用。

3）病毒悬液 + 除药处理 → 接种培养

观察除药处理对病毒滴度有无影响。

4）病毒悬液 → 接种培养

观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值。

5）未接种病毒的细胞 → 培养

观察细胞生长是否正常。

（2）悬液定量操作程序

1）第 1 组。吸取消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，根据试验规定量，吸取该最终样液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

2）第 2 组。吸消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，根据试验规定量，吸取最终样本 （或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

3）第 3 组。吸取病毒悬液 0.1ml，加 0.9ml细胞基础培养液，做除药处理。根据试验规定量，吸取最终样本（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

4）第 4 组。 吸取病毒悬液 0.1 ml， 加细胞维持液 0.9ml，不加消毒剂亦不做任何除药处理。根据试验规定量，吸取该病毒悬液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

5）第 5 组。 向未接种病毒的细胞管内，加入完全细胞培养基培养。

（3）评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格:

1）第 1 组无试验病毒，或仅有少量生长。

2）第 2 组有远较第 1 组为多，但明显较 3组～5组为少的试验病毒生长。

3）第 3、4、5 （组）试验病毒生长量相近。

4）连续 3 次试验取得合格评价。

5）可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。

2.1.1.10.7 脊髓灰质炎病毒灭活试验

（1）目的

测定消毒剂对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）灭活所需的剂量，以验证病毒污染物消毒实用剂量。

（2）实验原理

用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中脊髓灰质炎的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对脊髓灰质炎的灭活率。

（3）试验分组

1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。

2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试验和培养，观察脊髓灰质炎生长是否良好。

3）阴性对照组。用不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。

（4）脊髓灰质炎悬液定量灭活试验操作程序

1）从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有10ml完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。

2）取出低温冻存的脊髓灰质炎-1毒株，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管1.0ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。

3）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中备用。

4）取100μl有机干扰物质与100μl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待检消毒剂，立即混匀并记时。作用规定时间，立即取出0.1ml，加入中和剂中混匀；或用经鉴定合格的除药方法处理。

5）阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂。

6）各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行。

7）试验重复3次。

8）终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后在96孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞），在37℃，放置1h～2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2）培养，逐日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d，逐孔观察并记录细胞病变情况。

终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。

9）噬斑法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后接种于细胞培养瓶中，滴定各稀释度样本中残留的病毒量。

接种细胞前，将生长致密的单层细胞中的培养液倾出，加入1ml待测样品，放置37℃吸符1h～2h，倾出样液，加入含0.8%琼脂的细胞维持液3ml，冷却后翻转细胞瓶，放置37℃培养48h～72h。然后每瓶细胞加入2ml甲醛溶液固定数分钟，用自来水冲洗后加结晶紫溶液染色数分钟，冲洗干净后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区即为一个蚀斑单位，每毫升测试样品中的病毒含量计算：

pfu/ml＝平板平均蚀斑数×稀释倍数

注意：为了便于计数，病毒蚀斑数一般控制在每细胞瓶10pfu～30pfu。

（5）平均灭活对数值的计算

平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。

平均灭活对数值 = log No－log Nx

（6）评价规定

1）脊灰病毒灭活试验，可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤用化学消毒剂对病毒的灭活效果。病毒的灭活滴度，应达到4个对数值。

2）在正常情况下，3次试验的平均灭活对数值≥4.00，可判为对脊髓灰质炎病毒污染物消毒的实验室试验合格。同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在5～7 之间。

（7）注意事项

1）操作人员应具有基本的病毒学实验工作经验，尽量使用移液器与无菌一次性吸头。

2）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。

3）如使用病毒载体进行试验，可参照上述悬液定量试验程序，并遵照病毒学原理进行适当修改后使用。

2.1.1.10.8 艾滋病病毒灭活试验

（1）目  的

测定消毒剂对艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）灭活所需的剂量，以验证对该病毒污染物消毒实用剂量。

（2）实验原理  

用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中HIV 的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对 HIV 的灭活对数值。

（3）安全防护

试验中要求采取严密防护措施。我国规定所有接触 HIV 的试验均需在生物安全三级（biological safety level 3，BSL 3）实验室内进行，并制定有相应的安全防护措施。 在 HIV 灭活试验时，必须严格按照有关安全规定进行。

（4）试验分组

1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设立适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。所设组应能测出使 HIV 全部灭活所需的最低有效剂量（药物浓度与作用时间）。

2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入 HIV 悬液进行试验和培养，观察 HIV 生长是否良好。

3）阴性对照组。 用不含 HIV 的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。

4）消毒剂对细胞毒性组。取 100μl 待测消毒剂，加入含有100μl 用完全培养基制备的MT4 细胞悬液（含细胞400 000 个/ml）的 96 孔培养板内。置二氧化碳温箱（37℃）中培养 7 d，观察细胞生长情况，确定消毒剂对细胞无毒性的最高稀释度。

（5）HIV 悬液定量灭活试验操作程序

1）从液氮中取出冻存的 MT4 细胞，在 37℃ 温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有 10ml 完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞对数生长期时收获细胞用于消毒试验。

2）从液氮中取出冻存HIV-1毒种，接种于含10ml细胞悬液（含细胞700 000个/ml～800 000个/ml）培养瓶中。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管 0.5ml 分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。如不能立即离心，可暂将培养瓶冷冻保存于-20℃，并争取尽快离心分装。

3）取待测消毒剂，用无菌去离子水作 1:2、1:4、1:8 ...系列稀释。视消毒剂的类型和实验目的，确定最高稀释度。为防止污染培养液，必要时在试验前需将消毒剂过滤除菌。

4）取 50μl 待检消毒剂，与 50μl 病毒原液混合。在规定温度作用一定时间（根据试验要求确定作用时间和温度），立即加入0.9ml 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（400 000 个/ml），在37℃，放置 40min，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂；消毒剂对细胞毒性组试验中，用无菌去离子水代替病毒。

5）取出反应管，立即采取去除残留消毒剂处理。处理可用物理去除法或中和剂法（所用方法需先经试验证明，既可有效去除残留消毒剂，又对细胞和 HIV 无杀灭或抑制作用。

6）在 96 孔培养板上滴定样本中残留的病毒量。先在培养板（96孔）的各孔中，加入 100μl 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞 400 000 个/ml）。同时，用完全培养基对待滴定样本做 1：10 系列稀释，然后取 100μl 稀释好的样本加入已含 MT4 细胞悬液的 96孔培养板内。每个稀释度做 4 孔。

7）将按上述程序加液的 96 孔培养板，放入二氧化碳培养箱中（37℃，5% CO2），逐日在显微镜下观察细胞病变。被感染细胞融合肿胀，出现多核巨细胞。 第 4 d，在各反应孔内补加 50μl 新鲜完全培养基。第7d，逐孔观察并记录细胞病变情况。

8）试验重复 3 次。

（6）评价规定

1）对测试滴度的HIV，3次灭活试验后均应不再检出，此时的灭活对数值应≥4.00，可判为该消毒剂浓度与作用时间，对HIV污染物消毒的实验室试验合格。

2）在正常情况下，HIV阳性对照组病毒感染滴度（TCID50）对数值应在5～7之间。阴性对照组宿主细胞生长良好，并且无HIV 检出。所用浓度的消毒液对宿主细胞生长无不良影响。否则，根据发现的问题，或调整 HIV悬液浓度，或选择适宜消毒液浓度，或更换污染试剂和培养基，或改进其他有关条件后，重做试验。

（7）注意事项  

1）操作人员应具有较丰富的病毒学实验工作经验，必须绝对遵守BSL3实验室的安全制度。身体状态欠佳，或有伤口时，应暂时停止工作。

2）有感染可能性的操作，均应在BSL3实验室的层流负压超净工作台中进行。

3）一旦发生事故，有病毒感染或污染环境的可能时，切莫惊慌，除立即进行妥善消毒处理外，并应尽快报告实验室和单位领导。

4）本试验周期较长，在全部过程中应注意防止样本污染。

能量试验

2.1.1.11.1目的

测定连续加入细菌悬液对消毒剂杀菌作用的影响， 以验证该消毒剂用于多次消毒污秽物品(含较多有机物)，如浸洗拖布的消毒液、浸泡污染医疗器械的消毒液、浸泡洗手消毒液等实用剂量。

2.1.1.11.2  试验器材 

试验菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 大肠杆菌  8099 铜绿假单胞菌 ATCC 15442

(2)磷酸盐缓冲液 (PBS，0.03mol/L，pH值7.2～7.4)。

(3)标准硬水(硬度为 342mg/L)：见附录A。

(4)含中和剂营养肉汤培养基 (所用中和剂应为经试验鉴定合格者，见 2.1.1.5)。

(5)细菌定量杀灭试验所用器材 (见 2.1.1.7.2)。

2.1.1.11.3试验程序

(1)试验用菌悬液配制  选择上述试验菌中对所试消毒剂抗力强者作为试验菌， 配制菌悬液。用标准硬水将酵母粉配成50mg/L 溶液 (pH值6.9～7.1)。然后，吸取试验菌新鲜营养肉汤24h 培养物6.0ml，加于含 4.0ml酵母液试管中，混匀。依此配制成的菌悬液，所含菌量应为 106 cfu/ml～107cfu/ml。

(2)将待测消毒剂用硬水稀释成A(1.5x)、B(x)、C(0.5x) 等3 个浓度的消毒液 (括弧中的 “x” 代表杀菌试验所得有效浓度)， 各取 3.0ml 分装于无菌试管内。

(3)第 1 次，取试验菌悬液 1.0ml 加入到第 1 管 A 浓度消毒剂溶液内，立即混匀。

(4)在 A 管加菌悬液后8min，分别吸取A管内混合液20μl移种至A组的第1批5支盛有5.0ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。

(5)在第1 次加菌悬液后10min，第2次取1.0ml菌悬液加入到A浓度消毒剂管内，立即混匀。

(6)在第2次加入菌悬液后8min(即第1次加菌悬液后18min) 时，分别吸取 A 管内混合液20μl移种至 A 组的第2批5支盛有5ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。

(7)在第2次加入菌悬液后10min(即第1次加菌后20min)，取1.0ml 菌悬液加入到 A 浓度消毒剂管内，振摇混匀。

(8)在第3次加入菌悬液后8min(即第1次加入菌液后28min) 时， 分别吸取 A 管内混合液20μl移种至A组的第3批5支盛有5ml 含中和剂的营养肉汤培养基管中。

(9)B(x)、C(0.5x)两浓度药液的试验内容和操作程序，与上述A浓度者相同。3个稀释度消毒药液同一批进行操作时，可按表2-3 规定的时间和顺序进行。

表2-3 能量试验操作时间

(10)以2支含5ml中和产物 (用同次试验所用消毒剂与中和剂配制) 的营养肉汤培养基管，加入5μl试验菌液，作为阳性对照。

(11)以2支含 5ml与上相同的中和产物的营养肉汤培养基管，作为阴性对照。

(12)将以上各试验组和对照组样本管，置 37℃ 培养箱中培养 48h，观察是否有菌生长

(13)所有试验均在20℃±1℃ 水浴中进行。

(14)重复上述试验，每日1次，以连续取得3次同一评价结论者为准。

(15)试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其长菌量应在106cfu/ml～107cfu/ml。阳性对照管应变浑浊，阴性对照，不应有菌生长。

对照组结果不符合要求时，应检查原因，改正后重新进行试验。

2.1.1.11.4  评价规定

当阳性对照管有细菌生长(混浊)，阴性对照管无菌生长(透明)时，第 1 次和第 2 次移种的 5管样本中，有2 管或 2管以上不长菌的浓度组，作为合格浓度组。如 3 个浓度组均合格， 应降低消毒剂浓度继续试验; 反之，3个浓度组均不合格，则增加消毒剂浓度，直至找到最低合格浓度。连续3次重复试验，得到同样最低合格浓度，该最低合格浓度可作为设定反复浸泡用消毒液实用浓度的依据。

2.1.1.11.5  结果举例

设对某消毒剂能量试验结果如表2-4。

表 2-4  某消毒剂能量试验结果

注:  "+" 表示有菌生长， "-"表示无菌生长。

结论：此次试验结果，该消毒剂的最低合格浓度为1.2%。

2.1.1.11.6  注意事项

(1)试验应选用规定菌株。

(2) 3 个消毒剂浓度组操作，应严格按表 2-3规定的时间进行。

2.1.1.12 各种因素对消毒剂杀菌作用影响的测定

2.1.1.12.1  目  的

了解有机物、温度和 pH 对消毒剂杀菌作用的影响规律，为制定消毒剂的实用剂量提供参考。

2.1.1.12.2  试验器材

（1）菌片与菌悬液（按 2.1.1.2 要求和方法制备）。

（2）恒温水浴箱。

（3）冷水浴装置（可放入试管架的容器，以冰水调节水温）

（4）温度计。

（5）pH 计。

（6）有机物，根据消毒剂的使用对象选择，如酵母粉、血清、蛋白胨。

（7）中和剂（经中和剂试验鉴定合格）。

（8）盐酸（用无菌蒸馏水配制）。

（9）氢氧化钠（用无菌蒸馏水配制）。

2.1.1.12.3  试验微生物的选择 

根据所测消毒剂鉴定需要决定。一般情况下，除需用于特定微生物者外，对细菌繁殖体应选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，作为革兰阳性与阴性细菌的代表即可；用作灭菌剂，可使用枯草杆菌黑色变种芽孢。

2.1.1.12.4  消毒液浓度和作用时间的设定

各种因素影响的测定，均用杀灭相应微生物试验所得最低有效浓度，和 3个～4个作用时间进行杀灭试验。在 3个～4个作用时间中，以该最低有效浓度所需的最短有效时间为第 1 时间（T），其后的第 2 时间为第 1 时间的一倍（2T）。依此，第 3 时间为 3T，第 4 时间为 4T。试验结果应根据需要测出杀灭对数值达 5.00（消毒用）的最低有效剂量。必要时，可根据需要调整消毒剂浓度或作用时间，若第 1 时间较长（> 30min），可根据情况适当缩短作用时间的组距。对第1时间较短者（＜5min），可根据情况适当延长作用时间的组距。

2.1.1.12.5  有机物对杀灭微生物效果影响的测定

（1）如以小牛血清为有机物代表，应设置无小牛血清对照组；含25% 小牛血清组；含 50% 小牛血清组等3组。各组所用消毒液浓度和作用时间，见2.1.1.12.4。

（2）以稀释液配制的微生物悬液与无菌小牛血清，按 1：1 与3：1 比例混合，分别配成含50%与25%小牛血清的微生物悬液。此含小牛血清的微生物悬液，可用于悬液定量杀菌试验，亦可滴染菌片进行载体定量试验。

（3）试验中根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可参见2.1.1.7。

（4）其它有机物按此设计类推。各组试验应重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。

2.1.1.12.6  温度对杀灭微生物效果影响的测定

（1）设置10℃±1℃、20℃±1℃、30℃±1℃等，以10℃为间隔。各组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。

（2）对要求试验温度高于室温者，用恒温水浴箱（电热）调节；低于室温者用冷水浴装置（加适量冰水）调节。当上述温度调节装置到达要求温度后，放入装有试验样液的试管，同时放入一含与试验样液等量蒸馏水并插有温度计的试管。待试管内温度计指示到达试验所需温度时，开始随后的试验。

（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可分别参见2.1.1.7。

（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。

2.1.1.12.7  pH 对杀灭微生物效果影响的测定

（1）本项试验根据所测消毒剂使用溶液的 pH 值，分为以下 3 组进行：

第 1 组 pH 值  x - 2

第 2 组 pH 值  x

第 3 组 pH 值  x + 2

[例如，所测消毒剂使用溶液的 pH 值为 7.8，则 3 组的 pH 值应为：第 1 组 5.8，第 2 组 7.8，第 3 组 9.8]。

各 pH 组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。

（2）对消毒液 pH 的调节，先用 pH 计测定原消毒剂的pH，在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液，偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以调整。随时用pH 计测定消毒液的pH。当达到所要求的pH 后，停止调整，进行随后的试验。必要时，在pH 调整后可测定有效成分含量以观察是否受到pH 变化的影响。

（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序见 2.1.1.7。

（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。

2.1.1.12.8  评价规定

评价时，有机物影响试验应以不含外加有机物组（直接用稀释液配制微生物）的结果为对照；温度影响试验应以20℃±1℃ 组的结果为对照；pH 影响试验应以消毒剂使用溶液pH组的结果为对照。

（1）该组第 1个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果均合格，判为该组所试因素无影响。

（2）该组第 2个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有轻度影响。

（3）该组第 3个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有中度影响。

（4）该组只第 4 个作用时间的试验， 对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有重度影响。

（5）全部试验对所试微生物杀灭效果均不合格，判为本试验所试因素有严重影响。为取得消毒或灭菌的有效剂量，需增加消毒液浓度或作用时间，重新进行试验。

2.1.1.12.9  注意事项

（1）本试验目的是为制定消毒剂实用剂量提供必要的参考数据，系统研究各种因素对消毒剂杀灭微生物效果的影响，尚需作更多系统的观察。

（2）为加强各组结果的可比性和可重复性，非观察因素应保持稳定不变。例如，在观察有机物的影响时，除有机物浓度根据需要改变外，其他如温度和pH等因素均应先后一致。

2.1.2  消毒剂模拟现场和现场消毒鉴定试验

2.1.2.1  消毒剂对食(饮)具消毒效果的模拟现场鉴定试验

2.1.2.1.1  目的

鉴定消毒剂对食(饮)具上细菌的杀灭作用，以验证该消毒剂对食(饮)具消毒的实用剂量。

2.1.2.1.2  试验器材 

(1)大肠杆菌(8099)。对尚需用于杀灭其他特定细菌者，可增用该特定细菌进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。

(2))磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3)稀释液：见附录A。

(4)中和剂(按2.1.1.5方法鉴定合格者)

(5)胰蛋白胨大豆琼脂培养基

(6)无菌棉拭

(7)规格板(用可略弯曲的软性材料制备，中央留一大小为125px×125px空格作为采样部位)。

(8)试验用食(饮)具样本 瓷碗（盘）或竹（木）筷前端（周长50px， 长度为312.5px。

2.1.2.1.3 操作程序

（1）按产品使用说明书的用法，选定本试验拟用浓度和作用时间，分别进行大肠杆菌杀灭试验。

（2）用无菌规格板在试验用瓷碗（盘）中间标出染菌区(125px×125px)。用无菌吸管吸取菌悬液，分别滴加于染菌区，每区0.1ml，用无菌L棒在区内涂匀，置37℃恒温箱干燥。

对筷子取前端312.5px长度，蘸染预定量菌液后，并置37℃或室温干燥。

（3）试验组：将30个染菌碗或3 0个筷子样本，依次定时放入含消毒剂溶液的容器中，使其完全浸没。作用至规定时间后取出，弃掉消毒剂，向瓷碗（盘）内的染菌区加入5ml中和剂，用L棒刮洗染菌区，作用10min后，分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将筷子放入含20ml~25ml中和剂的试管中，使其完全浸没在中和剂中，电动混匀器震荡60s或振敲200次，作用10min后，分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将接种好的平皿放37℃恒温箱培养48h，计数菌落数，作为试验组。

（4）阳性对照组：将3个染菌碗或3只筷子样本不浸泡消毒剂，直接向瓷碗（盘）内的染菌区加入5ml中和剂，或直接将筷子放入含20ml~25ml中和剂的试管中。待试验组消毒处理完毕后，随试验组进行采样和检测。阳性对照组菌量应为1.25×107cfu/样本～1.25×108cfu/样本(相当于5×105cfu/cm2～5×106cfu/cm2)。

（5）阴性对照组：待试验组与阳性对照组试验结束后，将未用过的同批次中和剂、PBS接种培养基和未种菌的培养基等与上述两组样本同时进行培养，作为阴性对照。

（6）按下式计算每件食具上的生长菌落数。

每件食具样本生长菌落数（cfu/样本）=平板上平均菌落数×检测时样本稀释倍数

（7）计算杀灭对数值。

2.1.2.1.4 评价规定

以每种食（饮）具30个样本中大肠杆菌杀灭对数值均≥3.00所用消毒剂的浓度和作用时间为消毒合格剂量。

2.1.2.1.5 注意事项

(1)试验操作过程必须采取严格的无菌技术。直接或间接接触样本的器材必须经灭菌后   使用。模拟现场试验所用食(饮)具在染菌前亦必须经灭菌处理。

(2)每次试验必须设置阳性和阴性对照，绝不可省略。

2.1.2.2  消毒剂对医疗器械的消毒模拟现场试验

2.1.2.2.1  目的

鉴定消毒剂对人工污染于医疗器械上细菌芽孢的杀灭作用作用，以验证对医疗器械处理的实用剂量。

2.1.2.2.2  试验器材

(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)

(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)

(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基

（5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断，取其由轴至齿端部分，参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽灭菌后，烤干备用)。

(6)塑料试管(45px×450px)。

2.1.2.2.3 操作程序

(1)以载体浸泡定量杀菌试验进行消毒效果的测定。按产品使用说明书的剂量，选定本试验拟用浓度和和作用时间。

(2)染菌时，用无菌镊子将止血钳样本齿面朝上，并固定在无菌支撑物上。用0.1ml无菌吸管或定量无菌移液器，将0.02ml芽孢悬液滴染于齿部，用无菌L型铂金丝涂匀，置37℃恒温箱内干燥备用。

(3)取无菌平皿，按每个载体10ml用量加入消毒液，置20℃±2℃水浴中保温5min。

(4)将30个染菌样本浸没于消毒液中进行消毒处理。

(5)作用至规定时间，取出样本，分别移入含10ml中和剂溶液的塑料试管内。在手掌上振敲200次，分别取样液1.0ml倾注接种两个无菌平皿，放37℃恒温箱培养72h，计数菌落数，作为试验组。

(6)以无菌蒸馏水代替消毒液，将3个染菌样同样条件处理，然后与试验组样本同法进行活菌培养计数，作为阳性对照组，其菌量应在5×105 cfu/样本～5×106cfu/样本。

(7)试验结束后，将用过的同批次中和剂、采样液、稀释液接种培养基，进行培养;另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养，作为阴性对照。

2.1.2.2.4 评价规定

在规定作用时间内，阳性对照组均有菌生长，活菌培养计数达到规定的数量，阴性对照均无菌生长时，以对试验组30个样本上人工污染芽孢的杀灭率对数均值≥3.00，可判为消毒合格。

2.1.2.2.5  注意事项

与本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。 

2.1.2.3消毒剂对医疗器械的模拟现场灭菌试验

2.1.2.3.1目的 

用于验证消毒剂对人工染有芽孢的医疗器械灭菌效果。

2.1.2.3.2  试验器材

(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)

(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)

(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基

（5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断，取其由轴至齿端部分，参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽灭菌后，烤干备用)。

(6)塑料试管(45px×450px)

2.1.2.3.3 操作程序

(1) 按产品使用说明书中的最低使用浓度与0.5倍最短作用时间。

(2) 25个染菌样本制备按2.1.2.2.3中 (2)规定进行。

(3)无菌平皿，按每个载体10ml用量加入消毒液，置20℃±2℃水浴中保温5min。

(4)将20个染菌样本浸没于消毒液中进行灭菌处理，作用至规定时间，将样本取出，分别放于含10ml中和剂肉汤的试管内（共20支），置37℃培养箱中定性培养7d，观察最终结果，作为试验组。有菌生长者，肉汤培养基呈轻度浑浊，有皱褶状菌菌膜，轻轻振摇可见絮状沉淀，无菌生长者肉汤清澈透明。

（5）以标准硬水代替消毒液，将2个染菌载体依上同样条件处理，然后与试验组载体同法接种、培养、观察结果，作为阳性对照组。

(6)另取3个染菌样本，分别放入10ml中和剂溶液塑料试管内。振荡1min，或在手掌上振敲200次，取样液进行活菌培养计数。培养72h计数菌落。作为菌数对照组，其菌量应为5×105cfu/样本～5×106cfu/样本。

(7)试验结束后，将用过的同批次中和剂、采样液和稀释液接种培养基，进行培养，另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养，作为阴性对照。

(8)试验重复3次。

2.1.2.3.4 评价规定

各次试验组所有60个样本均无菌生长，同时阳性对照组均有菌生长，菌数对照组活菌培养计数达到规定的数量，阴性对照组均无菌生长时，可判定为灭菌合格。

2.1.2.3.5 注意事项

(1)灭菌效果观察时，应严格无菌操作，否则可将灭菌合格误判为失败。

(2)于本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。

2.1.2.4 连续使用稳定性试验

2.1.2.4.1目的  

验证消毒剂在反复取放浸泡医疗器械条件下的使用有效期。

2.1.2.4.2  试验器材

(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)

(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)

(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基：见附录A。

（5）试验样本[参照2.1.1.2.4（2）]。

(6)满载用医疗器械(选用医用剪刀、止血钳等小型器械，或根据需要选用其他器械。

(7)无菌带盖搪瓷盘。

2.1.2.4.3 操作程序

(1)以枯草杆菌黑色变种芽孢为试验菌。

(2)试验时，配制双份2000ml消毒液，分别盛装于2个无菌带盖搪瓷盘中。各放入清洁的试验用医疗器械，使达满载要求。每次试验，同时分别对2个搪瓷盘中的消毒液进行检测。

(3)搪瓷盘内放入器械后，每日将器械取出，用清水洗涤，沥干，再回放入消毒液中。连续每日将器械取出、洗涤、沥干、再放入，直至试验结束。

(4)放入器械至说明书上连续使用的最长时间，吸取消毒液样本，医疗器械消毒按消毒剂对医疗器械的消毒模拟现场试验(2.1.2.2)，医疗器械灭菌按消毒剂对医疗器械的模拟现场灭菌试验（2.1.2.3）的方法，测定该消毒液对芽孢的杀灭效果。

2.1.2.4.4 评价规定

试验重复3次，以3次试验均达到合格要求，可判为连续使用稳定性试验合格。

2.1.2.4.5  注意事项

盛装消毒液的搪瓷盘，在每次操作完毕后应加盖。

灭菌效果观察时，应严格无菌操作，否则可将灭菌合格误判为失败。

(3) 本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。

2.1.2.5  消毒剂对手消毒模拟现场试验

2.1.2.5.1  目的  

用于测定消毒剂对人工污染于手表面细菌的杀灭作用，并作为确定该消毒剂对手消毒实用剂量的参考。

2.1.2.5.2  试验器材 

（1）大肠杆菌8099或NCTC 10538，对尚需用于杀灭其他特定细菌目的者，可增用该特定细菌进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。

（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。

（3）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。

（4）中和剂（以TSB为溶剂，经鉴定合格）。

（5）液体肥皂 200g/L。

（6）参考样品：正丙醇 60%（V/V）与异丙醇 60%（V/V）。

（7）标准硬水：见附录A。

（8）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。

（9）无菌纱布巾。

（10）吸管、试管、平皿若干。

（11）振荡混合器。

2.1.2.5.3 试验步骤

(1)菌悬液的制备  取2支在TSB中培养18h～24h的大肠杆菌培养物分别接种于1LTSB大三角烧瓶中，在36℃±1℃培养箱中培养18h～24h，用TSB将其稀释为2×108cfu/ml～2×109cfu/ml菌悬液。

（2）将12名～15名志愿者随机分为两组，第一组使用参考样品，第二组使用试验样品

（3）使用液体肥皂洗手1min 去除手表面污染的自然菌，然后用无菌纱布将手擦干。

（4）将2×108cfu/ml-2×109cfu/ml大肠杆菌的菌悬液放入一无菌容器中，

（5）将手掌中间到指尖部位浸入菌悬液中，手指分开，停留５s，将手离开菌悬液，在空气中干燥３min。

（6）干燥后立即将拇指与其他手指尖在含 10ml TSB的平皿中搓洗１min，取适当稀释度接种平皿。计数菌落数，作为试验前菌数。

（7）不再重复污染手，立即进行消毒处理。

（8）试验样品组：按说明书介绍的用量、作用时间和使用频率以标准的洗手方法（如图2-1）搓擦30s～60s（卫生手消毒）或最长5min（外科手消毒）。以流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。立刻将拇指与其它手指尖在含10ml中和剂的平皿中搓洗1min，做适当稀释后，分别取样液1.0ml以倾注法接种两个无菌平皿，放37℃恒温箱培养48h，计数菌落数。

(9)参考样品组：对于卫生手消毒，取60%异丙醇3 ml到入手心中，按标准的洗手方法用力搓擦30s。以确保手的所有部位均匀接触异丙醇。重复使用异丙醇按上述方法搓擦使总的搓擦时间为60s。对于外科手消毒，使用60%正丙醇3ml，按标准的洗手方法用力搓擦，当接近干燥时，再加3ml正丙醇搓擦。以保持作用3min。用流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。其余步骤与试验样品组相同。

1.掌心对掌心搓擦     2.手指交错掌心对手背搓擦      3.手指交错掌心对掌心搓擦

4.两手互握互搓指背   5.拇指在长中转动搓擦          6.指尖在掌心中摩擦

图2-1  标准的洗手方法

(10) 在试验当日，第一组与第二组样品对换，重复上述试验。

(11) 分别计算参考样品组和试验样品组的菌数减少的对数值。

2.1.2.5.4 评价规定

(1) 试验样品的杀灭对数值大于或等于参考样品的杀灭对数值为合格。

(2) 若试验样品的杀灭对数值小于参考样品的杀灭对数值，应进行统计学处理，以确定差异是否显著。

(3) 若试验样品的杀灭对数值不显著小于参考样品的杀灭对数值，可判为消毒合格。若试验样品的杀灭对数值显著小于参考样品的杀灭对数值，表明该试验样品不符合本规范的要求。

2.1.2.5.5 注意事项

（1）试验必须在同一受试者、同一天、相同环境、同样条件下进行，使试验样品和参考样品的结果具有可比性。

（2）所有受试者应年满18岁，身体健康。手部皮肤应无破损、无皮肤病，手指甲短而干净。

（3）试验用菌悬液应在第1只手浸入后3h内使用。在1次试验中，无论使用试验样品还是参照样品，所有受试者手的染菌都应使用同一批菌悬液。

（4）对受试者，在每次试验结束时，应及时对双手进行彻底的消毒处理。

2.1.2.6 消毒剂对手消毒现场试验

2.1.2.6.1目的

测定消毒剂对手表面自然菌消毒所需使用的剂量，以验证该消毒剂对手消毒实用剂量。

2.1.2.6.2试验器材

（1）中和剂（中和剂经鉴定合格)

（2）无菌棉拭

（3）稀释液 0.1%吐温80的0.03mol/L磷酸盐缓冲液  pH7.2

（4）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。

（5）标准硬水：见附录A。

（6）无菌纱布巾

（7）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。

（8）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。

（9）振荡混合器

（10）吸管、试管、平皿若干。

2.1.2.6.3试验步骤

(1) 在使用现场，随机选定受试者。试验不少于30人次。

(2) 消毒前，在受试者双手相互充分搓擦后，让受试者左手指并拢，用无菌棉拭在含10ml稀释液试管中浸湿，于管壁上挤干后，在五指屈面指尖至指根，往返涂擦2遍，每涂擦一遍，将棉拭转动一次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入中和剂试管内，作为阳性对照组样本。

(3)根据消毒剂使用说明书的方法对右手进行消毒，对手的卫生消毒一般设定作用时间为1min， 对外科洗手后的泡手一般设定作用时间为3min。消毒后用中和剂代替稀释液，与阳性对照组同样的方法对受试者右手上残留的自然菌采样一次，作为试验组样本。

(4)分别将未用过的同批中和剂、稀释液各1.0ml、棉拭1份～2份作为阴性对照组样本。

(5)分别取试验组、阳性对照组和阴性对照组样本各1ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察最终结果。

(6) 计算杀灭对数值

2.1.2.6.4 评价规定

阳性对照组应有较多细菌生长，阴性对照组应无菌生长，以对30人次手上自然菌的平均杀灭对数值≥1.00可判为消毒合格。

2.1.2.6.5 注意事项

(1)本试验需有志愿者参与，重复人次较多，一人可多次受试，但不得在一批试验或同日反复参与，否则可影响结果的准确性。

(2) 受试者接受试验时，不得触摸任何表面，以免使手的试验部位沾染杂菌。

(3)棉拭涂抹采样，较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量， 以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致。

(4) 擦拭消毒时，涂药量要适宜，涂抹要均匀。

(5) 现场样本须及时检测，室温存放不得超过2h。否则应放4℃冰箱内，但亦不得超过4h。

2.1.2.7 消 毒 剂 对 皮 肤 消 毒 模 拟 现 场 试 验

2.1.2.7.1  目的  

测定消毒剂对人工污染于皮肤表面细菌的杀灭作用，以验证该消毒剂对皮肤消毒实用剂量。

2.1.2.7.2试验器材 

（1）试验菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 27217，对尚需用于杀灭其他特定细菌者，可增用该特定细菌进行试验。

（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），见附录A。

（3）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。

（4）中和剂（中和剂经鉴定合格）。

（5）液体肥皂 200g/L。

（6）金属筒 （直径55.00000000000001px、高度75px）。

（7）尼龙刮菌棒。

（8）无菌纱布巾。

（9）吸管、试管、平皿若干。

（10）振荡混合器。

（11）一次性接种环（直径4mm）。

（12）抗生素软膏。

（13）皮肤消毒剂。

（14）恒温箱。

2.1.2.7.3 试验步骤

（1）菌悬液的制备按2.1.1.2.3规定的方法和要求进行。

（2）使用液体肥皂清洗受试者前臂内侧1min，用自来水冲净残留皂液，然后用无菌纱布擦干，以去除前臂内侧表面污染的自然菌。

（3）用一端醮有印墨直径为75px的玻璃筒扣印在受试者的每只前臂中段（不要在手腕和肘皱褶处），划分出一个试验区。

（4）使用加样器取10μl上述菌悬液，接种于前臂试验区（使回收菌落数为2×106 cfu/试验区～1×107 cfu/试验区），用一次性接种环，把菌悬液涂成一圆形，与试验区边缘应有4mm～5mm的距离，在空气中自然干燥。

（5）根据消毒剂使用说明书的方法对右前臂内侧进行消毒，一般设定作用时间为1 min～3min。

（6）消毒后用中和剂对前臂上接种的区域进行取样。采样时，将金属筒放置于试验区中间部位，罩住染菌区，不要接触到盖有印墨的边缘。将1.0ml中和剂吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤60s，将筒内液体吸移至试管内，再加1.0ml中和剂对该区域内的皮肤进行第二次刮洗30s，将第二次擦洗的液体，注入含第一次刮洗液体的试管中，作为试验组样本。

（7）以蒸馏水代替消毒剂对左前臂中段做同样处理，作为对照组样本。

（8）每次试验分别将未用过的同批中和剂、稀释液各1.0ml作为阴性对照组样本。

（9）分别取适宜稀释度试验组、对照组样本和阴性对照组样本各1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h， 观察最终结果。

（10）计算杀灭对数值。

（11）试验不得少于15人次。

2.1.2.7.4．评价规定

对照组回收菌落数为2×106cfu/试验区～1×107cfu/试验区，阴性对照组应无菌生长，且对每一人次皮肤表面人工污染的金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均≥3.00可判为消毒合格。

2.1.2.7.5注意事项

（1）受试者录用标准

1）年龄介于18岁至65岁的男性或女性；

2）受试者应身体健康；

3）前臂皮肤应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题。

（2）排除受试者的标准，如果受试者有下列情况之一，不能被录用参加试验

1）怀孕妇女；

2）诊断患有糖尿病、肝炎、艾滋病（HIV阳性）、器官移植者。

（3）试验采样结束后，先用70%的酒精对受试者前臂进行消毒，然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏于试验区，以防皮肤感染。

（4）在试验完成后的48h至72h内，受试者如发现前臂上有小脓疱、水疱，隆起的红色痒疱，应及时通知检验单位。

2.1.2.8 消毒剂对皮肤消毒现场试验

2.1.2.8.1目的

测定消毒剂对皮肤表面自然菌消毒所需使用的剂量，以验证该消毒剂对手消毒的实用剂量。

2.1.2.8.2试验器材

（1）中和剂（中和剂经鉴定合格）。

（2）无菌棉拭。

（3）稀释液 0.1%吐温80的0.03mol/L磷酸盐缓冲液pH7.2。

（4）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。

（5）标准硬水：见附录A。

（6）无菌纱布巾。

（7）规格板(用牛皮纸制备，中央留一75px×250px的空格作为采样部位)121℃15min灭菌备用。

（8）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）。

（9）振荡混合器。

（10）吸管、试管、平皿若干。

2.1.2.8.3试验步骤

(1)在使用现场，随机选定受试者。试验不少于30人次。

(2)消毒前，让受试者将左右前臂内侧中段相互充分对搓后， 将规格板放于受试者左前臂内侧中段表面，用无菌棉拭在含10ml稀释液试管中浸湿，于管壁上挤干后，在规格板框定的区域内，横向往返涂擦10遍，纵向往返涂擦3遍，每涂擦一遍，将棉拭转动一次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入采样液试管内，振打200次。

(3)根据消毒剂使用说明书的方法对右前臂内侧进行消毒，一般设定作用时间为1min～3min。消毒后用中和剂代替稀释液，与阳性对照组同样的方法对受试者右前臂内侧表面残留的自然菌采样一次，作为试验组样本。

(4)分别将未用过的同批中和剂、稀释液和棉拭作为阴性对照组样本。

(5)分别取适宜稀释度的试验组、阳性对照组和阴性对照组样本各1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察最终结果。

(6) 计算杀灭对数值

2.1.2.8.4 评价规定

阳性对照组应有较多细菌生长，阴性对组应无菌生长，以对30人次批皮肤表面自然菌的平均杀灭对数值≥1.00，可判为消毒合格。

2.1.2.8.5注意事项

(1)本试验需有志愿者参与，重复人次较多，一人可多次受试，但不得在一批试验或同日反复参与，否则可影响结果的准确性。

(2)受试者接受试验时，不得触摸任何表面，以免使试验部位沾染杂菌。

(3)棉拭涂抹采样，较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量， 以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致。

(4)擦拭消毒时，涂药量要适宜，涂抹要均匀。

(5)现场样本须及时检测，室温存放不得超过2h。否则应放4℃冰箱内，但亦不得超过4h。

2.1.2.9  消毒剂对其它表面消毒模拟现场鉴定试验

2.1.2.9.1  目的

用于鉴定消毒剂对人工污染于一般物体[指除本规范已有专门规定如食(饮)具、医疗器械等以外的物体]表面细菌的杀灭作用，以验证该消毒剂对上述表面消毒的实用剂量。

2.1.2.9.2  试验器材

(1) 大肠杆菌(8099)与金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)。如需用于杀灭其特定微生物者，可增用该特定微生物进行试验。菌悬液制备，按2.1.1.2规定的方法和要求进行，检测菌量应在1.25×107 cfu/样本～1.25×108 cfu/样本(相当于5×105 cfu/cm2～5×106cfu/cm2)。

(2) 磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(3) 稀释液(含0.1%吐温80的PBS溶液)

(4) 中和剂(按2.1.1.5方法鉴定合格者)

(5) 胰蛋白胨大豆琼脂培养基

(6) 无菌棉拭

(7) 规格板(用不锈钢材料制备，中央留一 125px×125px的空格作为采样部位)

2.1.2.9.3 试验步骤

(1)以人工染菌实物如桌面、地面、墙壁等为消毒对象。在无特殊要求情况下，可用木制桌面为代表，进行消毒效果观察。

(2)每次试验，各类物品表面测试30个样本。

(3)染菌时，选物品较平的部位，于规格板中央空格内用无菌棉拭沾以菌悬液均匀涂抹被试表面的60个区块(各为625px2)。待自然干燥后进行试验。30个区块作为阳性对照区，30个区块为试验区。

(4)阳性对照组：将无菌棉拭于含5ml稀释液试管中沾湿，对30个对照组区块涂抹采样，每区块横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内，振打200次，作用10min。用稀释液做适当稀释。

(5)试验组：根据说明书中介绍的使用剂量将消毒剂喷雾或涂擦于物体表面进行消毒。消毒后，将无菌棉拭于含5ml中和剂试管中沾湿，分别对30个消毒区块进行涂抹采样，每区块横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原中和剂试管内，振打200次，作用10min。必要时用中和剂作适当稀释。

(6)试验结束后，将用过的同批次中和剂、稀释液各1.0ml接种培养基，作为阴性对照组样本。

(7)将阳性对照组、阴性对照组和消毒组样本，每份吸取1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察最终结果。

(8) 计 算 杀 灭 对 数值。

2.1.2.9.4 评价规定

试验重复3次，阳性对照组菌数符合要求，阴性对组无菌生长，所有样本的杀灭对数值均≥3.00，可判为消毒合格。

2.1.2.9.5 注意事项

(1)试验操作必须采取严格的无菌技术。

(2)每次试验均需设阳性和阴性对照，绝不可省略。

(3)消毒前后采样(阳性对照组和消毒试验组)，不得在同一区内进行。

(4)棉拭涂抹采样较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量，洗菌时敲打的轻重等等先后一致。

(5)现场样本须及时检测。室温存放不得超过2h，否则应置4℃冰箱内，但亦不得超过4h。

2.1.2.10  消毒剂对其它表面消毒现场鉴定试验

2.1.2.10.1 目的

用于鉴定消毒剂对一般物体[指除本规范已有专门规定如食(饮)具、医疗器械等以外的物体]表面自然菌的杀灭作用，以验证消毒剂对上述表面消毒的实用剂量。

2.1.2.10.2  试验器材

(1) 磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

(2) 中和剂

(3) 稀释液(含0.1%吐温80的PBS溶液)

(4) 无菌棉拭

(5) 规格板(用不锈钢材料制备，中央留一 125px×125px的空格作为采样部位)

(6) 胰蛋白胨大豆琼脂培养基

2.1.2.10.3 操作程序

在使用现场，按说明书介绍的用量、作用时间、使用频率和消毒方法消毒物体表面，检测样本数应≥30份。

(1)随机取物体表面(桌面、台面、门等)，用规格板标定2块面积各为625px2的区块，一供消毒前采样，一供消毒后采样。

(2)消毒前，将无菌棉拭于含5ml稀释液试管中沾湿，对一区块涂抹采样，横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内，震荡20s或振打80次，做适当稀释后，作为阳性对照组样本。

(3)根据规定的剂量，将消毒剂喷雾或涂擦于物体表面进行消毒。消毒后，将无菌棉拭于含5ml中和剂试管中沾湿，对消毒区块涂抹采样，横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原采样液试管内，电动混匀器震荡20s或振打80次，作为消毒组样本。

(4)试验结束后，将用过的同批次中和剂、稀释液各1.0ml接种培养基，作为阴性对照组样本。

(5)将阳性对照组、阴性对照组和消毒组样本，每份吸取1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察最终结果。

(6) 计 算 杀 灭 对 数.值。

2.1.2.10.4评价规定

试验重复3次，阳性对照组应有较多细菌生长，阴性对组应无菌生长，消毒样本的平均杀 灭 对 数 值 ≥1 ， 可 判 为 消 毒 合 格 。

2.1.2.10.5  注意事项：

(1)在现场试验中，自然菌的种类较复杂，平板上常出现大面积霉菌生长，导致无法计数菌落。此时，在两个平行的平板中如有一个平板可数清菌落数，即按该平板菌落数计算结果。如两平板均有大面积霉菌生长，应重新进行试验。

(2)试验操作必须采取严格的无菌技术。

(3)每次试验均需设阳性和阴性对照，绝不可省略。

(4)消毒前后采样(阳性对照组和消毒试验组)，不得在同一区块内进行。

(5)棉拭涂抹采样较难标准化，为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀，吸取采样液的量，  洗菌时敲打的轻重等等先后一致。

(6)现场样本须及时检测。室温存放不得超过2h，否则应置4℃冰箱内，但亦不得超过4h。

2.1.3  空气消毒效果鉴定试验

2.1.3.1  目的

检测消毒器械或消毒剂对空气中细菌的杀灭和(或)清除作用，以验证其对空气的消毒效果。其他方法对空气的消毒效果，亦可参照本试验的有关原则进行。

2.1.3.2  试验设备和器材

(1) 试验菌为白色葡萄球菌 8032，其菌悬液的制备方法见 2.1.1.2。

(2) 采样液[用于液体撞击式采样器采样。非化学因子杀菌试验时，用含抗泡沫剂（辛醇或橄榄油）的营养肉汤培养基；消毒剂杀菌试验时，用含相应中和剂的营养肉汤培养基（同样加入辛醇或橄榄油）]。

(3) 中和剂( 按 2.1.1.5 方法鉴定合格者)。

(4) 磷酸盐缓冲液( PBS，0.03 mol/L，pH 7.2 )。

(5) 普通营养肉汤培养基。

(6) 普通营养琼脂培养基。消毒剂杀菌试验时，尚需在其中加入相应的中和剂。

(7) 相邻的一对气雾柜或气雾室，一个用于消毒试验，一个用于试验对照。一对气雾柜或气雾室所处环境(包括温度、湿度、光照、密闭性、和通风条件等)应一致。柜(或室)宜以铝合金和玻璃构建。应安装温度和湿度调节装置以及通风机过滤除菌或其它消毒装置和相应管道，此外，还应开设供喷雾染菌、给消毒剂、采样等的袖套操作和样本传递等窗口。

(8) 喷雾染菌装置，包括空气压缩机、压力表、气体流量计和气溶胶喷雾器等。喷出细菌气溶胶微粒的直径 90% 以上应在 1μm～10μm 之间。

(9) 空气微生物采样装置，包括六级筛孔空气撞击式采样器、液体撞击式采样器、抽气设备、气体流量计等。

(10) 环境监测器材，如温度计、湿度计等。

2.1.3.3  试验阶段

空气消毒试验分为实验室试验、模拟现场试验与现场试验。三个阶段试验的特点见表 2-5。

2.1.3.4  实验室试验与模拟现场试验操作程序

(1) 取试验菌菌悬液，用无菌脱脂棉过滤后，再用营养肉汤培养基稀释成所需浓度。

(2) 同时调节两个气雾柜(或室)的温度、相对湿度至试验要求的温度和相对湿度。

(3) 将使用的器材一次放入气雾柜(或室)内，将门关闭。此后，一切操作和仪器设备的操纵均在柜(或室)外通过带有密封袖套的窗口或摇控器进行。直至试验结束，始可将门打开。

(4) 按设定的压力、气体流量及喷雾时间喷雾染菌。边喷雾染菌，边用风扇搅拌。喷雾染菌完毕，继续搅拌 5 min，而后静置 5 min。

（5）同时对对照组和试验组气雾柜(或室)分别进行消毒前采样，作为对照组试验开始前和试验组消毒处理前的阳性对照(即污染菌量)。气雾柜(或室)内空气中各阳性对照菌数应达5´104 cfu/m3～5´106 cfu/m3 。

表 2-5  各阶段空气消毒试验的特点

在模拟现场试验时，用六级筛孔空气撞击式采样器采样，采样时，将六级筛孔空气撞击式采样器放在柜室中央1m 高处(采样方法按采样器使用说明书进行)。在实验室试验时，用液体撞击式采样器采样，采样器置柜内中央处。

(6) 按产品说明书规定的方法，在试验组气雾柜(或室)内进行消毒。对照组气雾柜室同时作相应(不含消毒剂)处理。

(7) 作用至规定时间，对试验组和对照气雾柜(或室)按前述方法同时进行采样。继续作用至第二个预定消毒时间，再次按前述方法进行采样。如此按作用时间分段采样，直至规定的最终作用时间为止。

(8) 在实验室试验阶段，用液体撞击式采样器采集的样本，按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数，在 37℃ 培养箱内培养 48h，观察最后结果。

(9) 在模拟现场试验阶段，用六级筛孔空气撞击式采样器采样时， 采样平板直接放入 37℃ 培养箱中培养 48 h，观察最后结果，计数生长菌落数。

(10) 全程试验完毕，对气雾柜（室）表面和空气中残留的细菌做最终消毒后，打开通风机，过滤除菌排风，排除柜(或室)内滞留的污染空气，为下一次试验作好准备。

(11) 在完成试验组与阳性对照组采样和样本接种后，应将未用的同批培养基、采样液和PBS 等(各取1份～2份)，与上述两组样本同时进行培养或接种后培养，作为阴性对照。若阴性对照组有菌生长，说明所用培养基或试剂有污染，试验无效，更换无菌器材重新进行。

(12) 同一条件试验重复 3 次，每次均分别计算其杀灭率。3 次结果的杀灭率均 ≥99.90% 时，可判为消毒合格。杀灭率的计算方法如下:

Nt:空气中细菌的自然消亡率;  

V0 与 Vt:分别为对照组试验开始前和试验过程中不同时间的空气含菌量;

Kt:消毒处理对空气中细菌的杀灭率;

V0'与 Vt':分别为试验组消毒处理前、和消毒过程中不同时间的空气含菌量。

消毒前后空气中的含菌量按下列公式计算：

[ 举例:用某消毒剂对气雾柜内空气消毒 10 min，试验组消毒前空气含菌量为 100 000 cfu/m3，消毒后为 50 cfu/m3; 对照组处理前空气含菌量为 90 000 cfu/m3，处理后为 50 000 cfu/m3。该消毒剂作用 10 min 对空气中微生物的杀灭率按下法计算:

① 细菌在空气中 10 min 的自然消亡率为：

② 对空气中微生物的杀灭率为:

该次试验，消毒剂作用 10min，可将空气中细菌杀灭 99.91%。

2.1.3.5  现场试验

(1) 根据使用时的实际情况， 选择有代表性的房间并在室内无人情况下进行消毒效果观察。观察时，在消毒处理前用六级筛孔空气撞击式采样器进行空气中自然菌采样，作为消毒前样本 (阳性对照)。消毒处理后，再作一次采样，作为消毒后的试验样本。

(2) 采样时，采样器置室内中央1.0m 高处。房间大于10m2 者，每增加10m2 增设一个采样点。

(3) 因现场试验环境条件变化较多，难以统一，无法测定准确的自然沉降率，故只按所得消亡率(自然衰亡和消毒处理中杀菌的综合效果)做出验证结论。消亡率的计算按下式进行:

[举例:一无人手术室，消毒前采样，空气中的平均含菌量为 5000 cfu/m3。用某消毒剂喷雾对室内空气消毒 30 min 后采样，含菌量减至 50cfu/m3。该消毒剂处理 30 min 后，室内空气中自然菌的消亡率可按下法计算:

该消毒剂作用30 min，可使房间内空气中自然菌的消亡率达99.00%。

(4) 试验采样完成后，应将未用的同批培养基，与上述试验样本同时进行培养或接种后培养，作为阴性对照。阴性对照组若有菌生长，说明所用培养基有污染，试验无效，更换后重新进行。

(5) 试验重复 3 次或以上。计算出每次的消亡率。除有特殊要求者外，对无人室内进行的空气消毒，每次的自然菌消亡率均≥90% 者为合格。

2.1.3.6  注意事项

(1) 试验中，因控制统一的条件较难，故每次均需同时设置试验组与对照组。两组条件尽量保持一致。消毒前、后及不同次数间的环境条件亦应尽量保持一致。

(2) 注意记录试验过程中的温度和相对湿度，以便分析对比。

(3) 所采样本应尽快进行微生物检验，以免影响结果的准确性。

(4) 每次试验完毕，气雾柜、气雾室应充分通风。必要时消毒冲洗，间隔4 h后始可做第二次试验。

(5) 试验时，气雾柜(室)必须保持密闭，设有空气过滤装置，以防染菌空气外逸，污染环境。

(6) 试验时，气雾柜、气雾室或现场房间应防止日光直射，以免造成杀菌作用不稳定。

(7) 气雾柜排风过滤装置中的滤材应定期更换，换下的滤材应经灭菌后再作其他处理。

(8) 在气雾柜或密闭房间内进行消毒剂喷雾消毒时，用悬挂染菌样片法观察的消毒效果， 不能代表对空气的消毒效果。

2.1.4  水消毒效果鉴定试验

2.1.4.1 生活饮用水消毒效果鉴定

2.1.4.1.1  目的  

检测生活饮用水消毒剂与消毒器械的杀菌效果，以验证其对生活饮用水消毒能否达到卫生合格标准。

2.1.4.1.2  试验器材

(1) 大肠杆菌 (8099) 悬液。取 37℃ 培养 18h～24 h 的新鲜大肠杆菌斜面，用生理盐水洗下菌苔，混匀后再用生理盐水适当稀释，配制成试验用大肠杆菌悬液。

(2) 微孔滤膜滤器和滤膜(滤膜孔径为 0.45μm～0.65 μm，滤膜大小示滤器型号确定，目前常用有直径为 35 mm 和 47 mm 两种)。

(3) 抽滤水泵或气泵。

(4) 恒温水浴箱。

(5) 秒表。

(6) 三角烧瓶。

(7) 广口玻璃瓶 ( 500ml)。

(8) 无齿镊子。

(9) 品红亚硫酸钠培养基：见附录A。

(10) 中和剂(鉴定合格者，见 2.1.1.5 )。

(11) 细菌定量杀灭试验用其他器材(见 2.1.1.7 )。

(12) 天然水样。

(13) 模拟现场消毒装置(见 2.1.4.1.8 )。

(14) 磁力搅拌器。

2.1.4.1.3  试验阶段

饮用水消毒效果的鉴定应经过实验室杀菌试验，天然水样消毒试验两个阶段的检测。实验室试验的目的是以大肠杆菌为试验菌，用悬液定量杀菌试验法测出在试管中消毒所需的剂量。天然水样消毒试验是由自然水体取样，进一步验证受试消毒剂或方法对成分较复杂的天然水的消毒效果。对用于较大水体(如人工游泳池水、高层建筑二次供水)消毒的设备和方法，必要时尚需进行模拟现场或现场试验，以进一步验证其消毒效果。

由于生活饮用水的卫生标准，除微生物外还需考虑化学污染等方面，因此对其安全评价尚需由有关专业单位对其他条件，例如化学物质含量和 pH 值等，进行检测和判定，以对所鉴定的消毒剂或器械做出合格与否的综合评价。

2.1.4.1.4  试验菌污染水样的配制

试验用试验菌污染水样用于试验室消毒试验。配制时，将用生理盐水配制的大肠杆菌悬液加入脱氯的自来水或蒸馏水中，使其含菌量达到 5 ´ 104 cfu/100ml～5 ´ 105 cfu/100ml。

2.1.4.1.5  试验菌污染水样中活菌的培养计数

(1) 将纤维滤膜在蒸馏水中煮沸消毒 3 次，每次 15min。每次煮沸后需更换蒸馏水洗涤 2～3 次，以除去残留溶剂。

(2) 将滤器用压力蒸汽灭菌( 121℃，20 min )，也可用酒精火焰灭菌。

(3) 用无菌镊子夹取无菌的滤膜边缘，将粗燥面向上，贴放在已灭菌滤器的滤床上，稳妥地固定好滤器。取一定量待检水样(稀释或不稀释)注入滤器中，加盖，打开抽气阀门，在负压0.05 Mpa 下抽滤。

(4) 水样滤完后，再抽气约 5s，关上滤器阀门，取下滤器。用无菌镊子夹取滤膜边缘，移放在品红亚硫酸钠琼脂培养基平板上，滤膜截留细菌面向上。滤膜应与琼脂培养基完全紧贴，当中不得留有气泡，然后将平板倒置，放入 37℃ 恒温培养箱内培养 22h～24h。

(5) 观察结果和计数:计数滤膜上生长带有金属光泽的黑紫色大肠杆菌菌落，并计算出染菌水样中含有的大肠杆菌数 (cfu/100ml )。

2.1.4.1.6  实验室杀菌试验操作程序

（1）饮水消毒剂杀菌试验

1）试验分组

①试验组。申请消毒产品卫生许可批件时，按使用说明书规定的最短剂量，设定 1 个浓度，3 个作用时间（使用说明书规定的最短作用时间，最短作用时间的1.5倍和最短作用时间的0.5倍），测定其对大肠杆菌的杀菌效果。进行消毒产品监督检测时，按使用说明书规定的最短剂量，设定 1 个浓度，1 个作用时间（使用说明书规定的最短作用时间），测定其对大肠杆菌的杀菌效果。

② 阳性对照组，以未经消毒的试验菌污染水样进行活菌培养计数;

③ 阴性对照组，以试验所用同批次未经使用的培养基进行培养，观察有无细菌生长。

2）操作程序

①按 2.1.4.1.4所示方法配制试验菌污染水样。

②将装有试验菌污染水样的三角烧瓶放入恒温水浴箱(20℃±2℃)中，开动磁力搅拌器，使细菌在水中分布均匀。先取2份试验菌污染水样，按2.1.4.1.5 所示方法进行大肠杆菌活菌计数(阳性对照组)。

③待水样的温度恒定后加入消毒剂，迅速搅拌均匀。从开始加消毒剂起计时，按规定时间吸取水样，注入装有中和剂的无菌三角烧瓶中，以终止消毒作用。

④将中和后水样，分别取 100 ml，10 ml，1 ml 各 2 份，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠杆菌的活菌培养计数。

⑤将未接种大肠杆菌的试验用同批培养基平板 2 个，置温箱中培养(阴性对照组)。

⑥试验重复3次。

3）结果评价

当阳性对照组平均菌量在 5 ´ 104 cfu/100 ml～5 ´ 105 cfu/100 ml，阴性对照组均无菌生长时。在3次试验中均使大肠杆菌下降至 0/100 ml 的最低剂量，可判定为实验室试验中饮水消毒最低有效剂量。若阳性对照和阴性对照未达上述要求，应寻找原因，纠正后重做试验。

（2）饮水消毒器杀菌试验

本节饮水消毒器械指能产生消毒液并用于饮水消毒的饮水消毒装置。

1）试验分组

①试验组。申请消毒产品卫生许可批件时，按使用说明书规定的最低剂量，设定 1 个作用浓度（使用说明书规定的最低作用浓度）和3 个作用时间（使用说明书规定的最短作用时间，最短作用时间的1.5倍和最短作用时间的0.5倍），测定其对大肠杆菌的杀菌效果。进行消毒产品监督检测时，按使用说明书规定的最低剂量，设定 1 个浓度（使用说明书规定的最低作用浓度）和1 个作用时间（使用说明书规定的最短作用时间），测定其对大肠杆菌的杀菌效果。

②阳性对照组，以未经消毒的试验菌污染水样进行活菌培养计数;

③阴性对照组，以试验所用同批次未经使用的培养基进行培养，观察有无细菌生长。

2）操作程序

①按 2.1.4.1.4 所示方法配制试验菌污染水样。

②取 2 份试验菌污染水样，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠杆菌活菌计数(阳性对照

组)。

③应用气压法或水泵法进行消毒处理。应用气压法时，按要求联接高压( 2 kg/cm2～3 kg/cm2 )气源、耐压水样贮水器（3 kg/cm2～5 kg/cm2 ）、流量计和饮水消毒器。应用水泵法时，则按要求联接耐压水样贮水器（3kg/cm2～5 kg/cm2 ）、水泵、流量计和饮水消毒器。然后将加有试验菌的水样通过消毒器，将消毒过的水样放置至规定时间，再分别取其加于含中和剂的灭菌三角瓶中，混匀。分别吸取中和后水样 100ml，10ml，1ml 各 2 份，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠杆菌的活菌计数。

④将未接种大肠杆菌的试验用同批培养基平板 2 个，置培养箱中培养(阴性对照组)。

⑤试验重复 3 次。

3）结果评价

当阳性对照组平均含菌量在5 ´ 104cfu/100ml～5 ´ 105cfu/100ml。阴性对照组均无菌生长时。在3次试验中使大肠杆菌均下降至 0/100ml的最低剂量，可判定为实验室试验中饮水消毒最低有效剂量。

若阳性对照组和阴性对照组含菌量未达上述要求，应寻找原因，纠正后重做试验。

（3）饮水过滤器除菌试验

1）试验分组

①试验组。申请消毒产品卫生许可批件时，按使用说明书规定的最大流量，测定其对大肠杆菌的除菌效果。

②阳性对照组，以未经消毒的试验菌污染水样进行活菌培养计数。

③阴性对照组，以试验所用同批次未经使用的培养基进行培养，观察有无细菌生长。

2）操作程序

①按 2.1.4.1.4 所示方法配制试验菌污染水样。

②取 2 份试验菌污染水样，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠杆菌活菌计数(阳性对照

组)。

③按使用说明书规定的最大流量，将试验菌污染水样(见 2.1.4.1.4 )分段通过饮水过滤除菌装置。按规定过滤的水量，用无菌三角瓶分段采集:初始、1/4、2/4、3/4、4/4 等各段流出的水样(不需加中和剂)。

④对过滤后各段水样，分别取 100ml、10ml、1ml各 2 份，进行大肠杆菌活菌培养计数 (见 2.1.4.1.5 )。

⑤将未接种大肠杆菌的试验用同批培养基平板 2 个，置培养箱中培养(阴性对照组)。

⑥试验重复 3 次。

3）结果评价

当阳性对照组平均含菌量在 5 ´ 104cfu/100ml～5 ´ 105 cfu/100ml。阴性对照组均无菌生长时。在 3 次试验所有流量段水样中大肠杆菌下降至 0/100ml 时，可判为实验室试验中饮水消毒效果合格。若阳性对照组和阴性对照组含菌量未达上述要求，应寻找原因，纠正后重做试验。

2.1.4.1.7杀菌效果影响因素测定试验操作程序(用于饮用水化学消毒试验)

（1）水温影响试验:将人工染有大肠杆菌的水样，温度分别调控在 5℃±2℃、20℃±2℃、30℃±2℃ 条件下，对不同温度的水样，按说明书上规定的最低使用剂量（1个浓度，1个作用时间）进行杀菌试验，观察水温的影响。试验程序同2.1.4.1.5或2.1.4.1.6。试验重复3次。3次试验中，3个温度组杀菌效果均达合格标准，判为温度对该消毒剂杀菌效果影响不明显，所试剂量可在 5℃～30℃条件下使用。否则应依据杀菌效果确定仅可在杀菌效果均达合格标准的温度区间内使用。试验中应设阳性对照和阴性对照组。两对照组结果未达要求见 2.1.4.1.6（1）3），应寻找原因，纠正后重做试验。

（2）有机物影响试验

①腐殖酸配制：取 0.1g 腐殖酸（分析纯）用少许 2.0 mol/L 氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水 50 ml，用滤纸过滤至 100 ml 容量瓶中，用 2.0 mol/L HCl 溶液调节 pH 值至中性，并定容至 100 ml，比色测定实际色度。

②水样制备：在水样中加入腐殖酸，比照标准色度管，使色度各为 0度、10度、15 度，然后分别加入大肠杆菌悬液，配成不同色度的人工染有大肠杆菌水样。

③消毒处理：按说明书上推荐的最低使用剂量( 1 个浓度，1 个作用时间)进行杀菌试验，观察有机物的影响。试验程序同 2.1.4.1.6（1）或2.1.4.1.6（2）。试验重复 3 次。

④ 3 次试验中，3 个浓度的有机物组杀菌效果均达合格标准，判为有机物对该消毒剂杀菌效果影响不明显，所试剂量可用于色度低于 15 度水的处理。否则应依据杀菌效果确定仅可用于低于杀菌效果均达合格标准色度水的处理。试验中应设阳性对照和阴性对照组。两对照组结果未达要求见 2.1.4.1.6（1）3），应寻找原因，纠正后重做试验。

3）水中 pH 值的影响试验

①水样制备：用氢氧化钠（分析纯）或盐酸（分析纯）调水样 pH 值分别调为 6.5，7.0和 8.5，然后加入大肠杆菌悬液，配成不同 pH 值的试验菌污染水样。  

②消毒处理：按说明书上推荐的最低使用剂量(1 个浓度，1 个作用时间)进行杀菌试验，观察 pH 值的影响。试验程序同 2.1.4.1.6（1）或 2.2.1.4.1.6（2）。试验重复 3 次。

③ 3 次试验中，3 种 pH 值的消毒剂浓度杀菌效果均达合格标准，判为 pH 值对该消毒剂杀菌效果影响不明显，所试剂量可用于 pH值6.5～8.5 水的处理。否则应依据杀菌效果确定仅可在杀菌效果均达合格标准的 pH 值区间内使用。试验中应设阳性对照和阴性对照组。两对照组结果未达要求见 2.1.4.1.6（1）3），应寻找原因，纠正后重做试验。

2.1.4.1.8  模拟现场试验和现场试验

考虑到实用情况下各种水质对消毒效果的影响，根据产品申报的使用范围，选用天然水样如井水、河水、湖水或高层建筑贮水箱的水等进行消毒试验。

（1）饮水消毒剂对天然水样杀菌试验

1)根据说明书的最低使用剂量选择 1 个浓度，1 个作用时间，对天然水样进行杀菌试验。同时设置阳性对照组与阴性对照组。

2)将装有天然水样的三角烧瓶放入恒温水浴箱( 20℃±2℃ )中，开动磁力搅拌器，使细菌在水中分布均匀。取 2 份同批同类天然水样，每份 100ml，按 2.1.4.1.5 所示方法计数大肠菌群数(阳性对照组)。

3)待水样的温度恒定后，加入消毒剂，迅速搅拌均匀。从开始加消毒剂起计时，按规定时间吸取水样，注入装有中和剂的无菌三角烧瓶中，以终止消毒作用。

4)将中和后水样，分别取 100ml 2 份，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数。

5)将未接种水样的试验用同批培养基平板 2 个，置培养箱中培养(阴性对照组)。

6)试验重复 3 次。当阳性对照组均有菌生长。阴性对照组均无菌生长时，可判定在 3次试验中均使大肠菌菌群下降至 0/100ml ，可判定为对天然水样消毒合格。

7)如阳性对照组含菌量未达上述要求和阴性对照组有菌生长，应寻找原因，纠正后重做试验。

（2）饮水消毒器对天然水样杀菌试验

1)根据使用说明书的最低使用剂量选择 1 个浓度，1 个作用时间，对天然水样进行杀菌试验。

2)试验前，先取 2 份试验用天然水样，每份 100ml，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数(阳性对照组)。然后，将天然水样本按 2.1.4.1.6（2）2） 要求通过消毒器进行消毒处理，将处理后水样移到含中和剂的三角烧瓶中，混匀。

3)将中和的水样 2 份，每份100ml，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数。

4)大肠菌菌群的活菌培养计数量，按 2.1.4.1.5 所示方法检测。用滤膜过滤法检测时，所用水量应一致，约数毫升。污染严重的天然水，检测时可适当稀释。

5)将未接种水样的试验用同批培养基平板 2 个，置培养箱中培养(阴性对照组)。

6)试验重复 3 次。当阳性对照组均有大肠菌群生长，阴性对照组均无菌生长时，在 3 次试验中均使大肠菌群下降至 0/100ml ，可判定为对天然水样消毒合格。

7)如阳性对照组含菌量未达上述要求和阴性对照组有菌生长，应寻找原因，纠正后重做试验。

（3）饮水过滤器对天然水样的除菌试验

1)取 2 份试验用天然水样，每份 100ml，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数。所得结果作为过滤前含菌量(阳性对照组)。

2)按过滤器产品规定流量，将天然水样分段通过过滤器。按规定过滤的水量，用无菌三角瓶分段采集:初始、1/4、2/4、3/4、4/4 等各段流出的水(不需加中和剂)。

3)对过滤后各段水样，分别取 100ml、10ml、1ml 各 2 份，按 2.1.4.1.5 所示方法进行大肠菌菌群的活菌培养计数。

4)将未接种水样的试验用同批培养基平板 2 个，置培养箱中培养(阴性对照组)。

5)试验重复 3 次。当阳性对照组均有菌生长，阴性对照组均无菌生长，3 次试验中所有流量段水样大肠菌群均降至 0/100ml，可判为对天然水样的消毒效果合格。

6)如阳性对照组和阴性对照组含菌量未达上述要求，应寻找原因，纠正后重做试验。

（4）高层建筑二次供水消毒设备和方法

对较大水体消毒设备和方法的鉴定，在模拟现场和现场试验中选做其一即可，但首先应考虑后者，只有在无法进行现场试验时，才做模拟现场试验。大水体现场消毒试验的操作程序，随当时当地情况，设备大小和所采取的消毒方法而定。

1)高层建筑二次供水消毒有两种主要方式，一是直接对贮水池中的水用物理或化学法消毒，一是将贮水池水引出通过消毒装置(如紫外线照射装置、过滤装置或消毒剂添加和搅拌装置等)进行消毒，遂后再输送到用户。

2)直接对水池中水进行消毒的设备和方法的鉴定，可参照游泳池水消毒设备和方法鉴定的有关要求进行消毒和采样检测(见 2.1.4.2 )。试验剂量选用使用说明书中规定者，样本按 2.1.4.1.5 所示方法进行活菌培养计数。检测中阴性对照组的设置和结果的评价，与天然水样杀菌试验相同[见 2.1.4.1.8（1）；2.1.4.1.8（2）；2.1.4.1.8（3）]。但检测需重复5次，结果均符合要求者(使用含氯消毒剂消毒的水样，剩余氯量为 0.3 mg/L～0.5mg/L )可判为合格。

3)将水引出后消毒的设备和方法的鉴定，可在进入消毒器和消毒后出水口管道上各加一 三通阀门，分别采集消毒前和消毒后水样。将样本按 2.1.4.1.5 所示方法进行活菌培养计数。试验剂量选用使用说明书规定者。检测中阴性对照组的设置和结果的评价，与天然水样杀菌试验相同[见 2.1.4.1.8（1）；2.1.4.1.8（2）；2.1.4.1.8（3）]。但检测需重复 5 次，结果均符合要求者(使用含氯消毒剂消毒的水样，剩余氯量为 0.3 mg/L～0.5 mg/L )可判为合格。

4)对条件不容许加装三通阀门时，可进行模拟现场试验。先设一大型水箱(大小根据鉴定的消毒设备流量和试验时间计算)，在其出水口下游用管道依次连接水箱出口阀门、排水泵、三通阀门(一端接下面的流量计，另一端接一回流管，必备需要时可将菌悬液送回水箱)、流量计和所鉴定的消毒装置。消毒装置的进水口前装一三通阀门，以备采集阳性对照水样。

试验时，水箱内盛装含大肠杆菌悬液(大肠杆菌浓度在5´104cfu/100ml～5´105cfu/100ml，见 2.1.4.1.4 )的水样。打开水箱出口阀门，根据流量计所示，用阀门和水泵控制流出水样的量和压力，并使按规定流量进入消毒装置。当水流按规定流量稳定地由消毒装置出水口流出后，先采阳性对照水样，而后由消毒装置出水口采集消毒后水样。将水样按 2.5.5 所示方法进行活菌培养计数。试验剂量选用使用说明书规定者。检测中，阴性对照组的设置和结果的评价，与天然水样杀菌试验相同[见 2.1.4.1.8（1）；2.1.4.1.8（2）；2.1.4.1.8（3）]。但检测需重复 5 次，结果均符合要求者(使用含氯消毒剂消毒的水样，剩余氯量为 0.3 mg/L～0.5 mg/L )可判为合格。

其他类似设备和方法亦可参照有关原则进行。

2.1.4.2人工游泳池水消毒效果鉴定

(1) 水样采集。游泳池水面≤1000 m2，设 2 个采样点，超过 1000m2 的，设3 个采样点。

(2) 鉴定时应在暑季游泳人员处于高峰期时进行。室内游泳池可根据情况在其他季节进行，但亦应在游泳人员的高峰期。

(3) 采样时，使用无菌玻璃瓶在水面下 30 cm 深处采集。再将水样加入有适量鉴定合格的中和剂溶液(见 2.1.1.2.5 )的无菌玻璃瓶中。每点采 1 个样本。每日采 2 次，一次在清晨消毒前(作为阳性对照)，一次在消毒后当日游泳人员高峰时，作为消毒后样本。

(4) 试验剂量选用说明书规定者。对样本，应检测细菌总数和大肠菌群数。使用含氯消毒剂时，还应测定水中的剩余氯含量。检测方法按《公共场所卫生标准监测检验方法》中的规定进行。

(5) 消毒后样本检测结果，细菌总数应≤1000cfu/ml，大肠菌群≤18cfu/L (见游泳场所卫生标准))。

(6) 检测按日重复 5 次。5 次全部符合上述要求者可判为合格。

2.1.4.3 注意事项

（1）在消毒前，对饮水消毒器与饮水过滤器，应用无菌水冲洗和通过5 min～10min，以消除内表面污垢并证明管路通畅。

（2）水处理中，极易遭污染，故试验材料、采样口和操作应严格保持无菌要求，否则可造成较大误差。

（3）模拟试验所用多余的菌悬液、水样等，应消毒后方可排放。所用设备与物品亦须进行彻底消毒后再进行下一次试验。

2.1.5  灭菌与消毒器械消毒功效鉴定试验

2.1.5.1  干热灭菌柜

2.5.1.1.1  目的

测定干热灭菌柜(下简称灭菌柜)对细菌芽孢的杀灭效果，以验证其灭菌性能是否符合设计规定。

2.1.5.1.2  试验器材

(1) 枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢菌片。染菌载体( 10mm × 10mm，以不锈钢片或玻片为代表，必要时可随灭菌对象，增用或改用其他载体)。菌片上细菌芽孢在 160℃±2℃ 条件下，存活时间 ≥3.9 min，杀灭时间 ≤19 min，D 值为 1.3min～1.9min。

(2) 营养肉汤培养基(见：附 A )。

(3) 活菌培养计数所需器材(见 2.1.1.2 )。

(4) 使用说明书中规定灭菌柜可以处理的物品( 装填灭菌柜，使达满载要求 )。

(5) 多点温度测定仪。

2.1.5.1.3  柜内温度测定

将温度测定仪的多个探头，分别放于灭菌柜的各层内、中、外不同部位。在柜内摆放模拟的常规处理物品，至使用说明书规定灭菌时的最高量(满载)。关闭柜门，开启电源，按灭菌柜设计程序进行灭菌。每 3 min，记录各点的温度。试验重复 3 次，计算各点不同时间的平均温度，并在试验报告中以图表列出。

2.1.5.1.4  灭菌试验

(1) 根据试验要求，制备枯草杆菌黑色变种芽孢悬液和芽孢样片。

(2) 每次试验取 2 个菌片为一组，平放于无菌平皿内，勿重叠。加盖，分置于灭菌柜的各层，内、中、外不同部位。试验时，灭菌柜内除菌片样本外，还应满载以模拟的常规处理物品。

(3) 关闭柜门，开启电源，按灭菌柜设计程序进行灭菌。灭菌完毕，取出平皿，将菌片取出接种于含 5.0ml 营养肉汤培养基试管中，置 37℃ 培养箱内作定性培养。72h 后观察结果。

肉汤管混浊者表示有菌生长，判为阳性; 肉汤管澄清者表示无菌生长，继续培养至第 7d，若仍无菌生长，判为阴性。

对难以判定的肉汤管，取其中 0.2ml 悬液接种营养琼脂平板，用灭菌 L 棒涂抹匀，置37℃ 培养箱中培养。48 h 后涂片染色，在显微镜下观察菌落形态，或进一步做其他试验，以判断生长者是否为试验菌。若有非试验菌污染，应查找原因重新进行试验。

(4) 测试中，应同时设立定性和定量阳性对照组(菌片对照)与阴性对照组(培养基对照)。

(5) 定量阳性对照组，以同批试验用菌片放在室温下，待试验组灭菌接种后，立即将该菌片 2 片分别移入含 5.0mlPBS试管中，各振荡 80次洗涤。按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。

(6) 定性阳性对照组，以同批试验用菌片放在室温下，待试验组灭菌接种后，立即将试验菌片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，放入培养箱中作定性培养，观察细菌生长情况。

(7) 阴性对照组，以空白样片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，同时将未接种过的营养肉汤培养基放入培养箱中作定性培养，观察有无细菌生长。

(8) 试验重复 5 次。

(9) 在 5 次试验中，每次试验中阳性对照菌片的回收菌量均应达5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性阳性对照组，细菌生长良好；阴性对照应无菌生长。阳性或阴性对照若有不符合上述要求的结果，试验作废，重新进行。

2.1.5.1.5  评价规定

(1) 在 3 次测定温度的试验中，各点平均温度均达设计要求。

(2) 在 5 次灭菌试验中，各次试验定量阳性对照的回收菌量均达 5×105cfu/片～5×106cfu/ 片；定性阳性对照组，细菌生长良好；阴性对照组样本应无菌生长。所有试验菌片均无细菌生长时，可判为干热灭菌合格。

2.1.5.1.6  注意事项

(1) 干热灭菌效果检测，应使用枯草杆菌黑色变种芽孢，不得使用嗜热脂肪杆菌芽孢，因在干热条件下，前者对干热的抗力较后者为强。

(2) 灭菌柜柜室容积和加热装置的变化，均可影响消毒效果，故在这方面的设计有所变动时，杀菌效果应重新测定。

(3) 灭菌效果观察，样本检测稍有污染即可将灭菌成功的结果全部否定，故试验时必须注意防止环境的污染和严格遵守无菌操作技术规定。

(4) 柜室内满载与非满载，结果差别较大，故正式试验时必须在满载条件下进行。

2.1.5.2  红外线消毒碗柜

2.1.5.2.1  目的

检测红外线消毒碗柜 (下简称消毒碗柜) 对餐(饮)具的消毒效果，以验证其杀灭微生物性能是否符合设计规定。

2.1.5.2.2  试验器材

(1) 大肠杆菌( 8099 )悬液。

脊髓灰质炎病毒悬液。

染菌玻片( 10mm×10mm) 载体（必要时可随消毒对象，增用或改用其他载体）

(4) 活菌培养计数所需器材(见 2.1.1.3 )。

(5) 病毒灭活试验所需试液、培养基与器材(见 2.1.1.10 )。

(6) 食(饮)具(种类与数量按使用说明书规定，用于装填消毒碗柜进行满载试验)

(7) 多点温度测定仪

2.1.5.2.3  柜内温度测定

将温度测定仪的多个探头，分别放于消毒碗柜每层的内、外两点(大型碗柜可在内、中、外 3点放置)，摆放食(饮)具至使用说明书规定的最高装载量(满载)。关闭柜门，开启电源，按消毒碗柜规定程序进行消毒。每 3 min，记录各点的温度。试验重复 3 次，计算各点不同时间的平均温度，并以表列出。

2.1.5.2.4  大肠杆菌杀灭试验

(1) 按 2.1.1.2 所示方法制备大肠杆菌菌片(载体为玻片)。

(2)在消毒碗柜满载的情况下，将干燥大肠杆菌菌片置无菌平皿内，每平皿放 2 片，勿重叠。在消毒碗柜每层的内、外两个点各放一含菌片的平皿(大型碗柜可在内、中、外各放一平皿)，打开平皿盖。

(3) 关闭柜门，开启电源，按消毒碗柜原设计程序进行消毒。消毒完毕，按说明书规定的时间打开柜门，取出平皿。将菌片移入含 5ml PBS 试管内，按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。

(4) 在上述消毒试验时，将未消毒菌片，放置室温下，当消毒组试验完毕后，取该菌片进行活菌培养计数，作为阳性对照。另将同批培养基与 PBS 等培养，作为阴性对照 。

(5) 试验重复 3 次，其平均杀灭率应按 2.1.1.7 的规定进行计算和表达。

(6) 在 3 次试验中，每次阳性对照回收菌数均达5×105cfu/片～5×106cfu/片，阴性对照无菌生长，阳性和阴性对照组结果若不符上述要求，试验作废，重新进行。

2.1.5.2.5  脊髓灰质炎病毒灭活试验

(1) 按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求，用玻片为载体。

(2) 在消毒碗柜满载的情况下，将干燥的染有脊髓灰质炎病毒的载体置无菌平皿内，每平皿放 2 片，勿重叠。在消毒碗柜每层的内、外两个点各放一含染有脊髓灰质炎病毒载体的平皿(大型碗柜可在内、中、外各放一平皿)，打开平皿盖。

(3) 关闭柜门，开启电源，按原规定程序进行消毒。消毒完毕，按说明书规定的时间，打开柜门，取出平皿。将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振荡洗涤后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒的感染滴度。

（4）阳性对照，将未消毒的染有脊髓灰质炎病毒的载体 2 片，放置于消毒碗柜外室温下。待试验组消毒完毕后，立即将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒的感染滴度。脊髓灰质炎病毒的感染滴度应≥105 TCID50。

（5）阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培养基无污染，细胞是否生长良好。

(6) 试验重复 3 次。

(7) 根据各组的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分别计算其对病毒的灭活指数，病毒的灭活指数应达 4 个对数值。

2.1.5.2.6  评价规定

对消毒碗柜实验室试验所得消毒效果的评价，应以对微生物的杀灭效果为准。当所测结果均达到以下要求者可判为合格：

(1) 柜内最低温度点达到 120℃，并可持续 15min 以上。

(2) 对大肠杆菌，每次试验，阳性对照组回收菌数均达5×105cfu/片～5×106cfu/片，阴性对照无菌生长，对大肠杆菌的杀灭对数值，各点均 ≥3.00为消毒合格。

(3) 对脊髓灰质炎病毒，每次试验，培养基无污染，细胞生长良好。脊髓灰质炎病毒感染滴度（TCID50 ）≥105，灭活对数值≥ 4.00。可判为消毒合格。

2.1.5.2.7  注意事项

(1) 消毒碗柜内满载与非满载，结果可有相当大差别，故正式试验必须在满载条件下进行。

(2) 不同大小的消毒碗柜，柜内装有红外线灯的功率或安装支数，均可影响消毒效果，故在这方面的设计有所变动时，应重新测定。

(3) 大肠杆菌杀灭试验注意事项见 2.1.1.7。

(4) 脊髓灰质炎病毒灭活试验注意事项见 2.1.1.10。

2.1.5.3 微波灭菌柜

2.1.5.3.1  目的

测定微波灭菌柜（下简称灭菌柜）对微生物的杀灭效果，以验证其消毒或灭菌性能是否符合原设计规定。

2.1.5.3.2  试验器材

(1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、龟分枝杆菌（ATCC93326）、枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢等细菌或芽孢悬液。

(2) 染菌载体( 10mm×10mm，以布片或玻片为代表，必要时可随灭菌对象，增用或改用其他载体)。

(3) 微波漏能测试仪(检测灭菌柜微波有无泄漏)。

(4) 营养肉汤培养基：见附录A。

活菌培养计数所用器材(见 2.1.1.2 )。

(5) 使用说明书中规定的处理的物品(装填灭菌柜，使达满载)。

2.1.5.3.3细菌及其芽孢和真菌杀灭试验操作程序

（1）按 2.1.1.2 所示相关方法制备试验用细菌及其芽孢和真菌菌片。若无特殊要求，菌片以布片为载体( 10mm×10mm )。每一牛皮纸小袋装2个菌片。

（2）按实用情况，在灭菌柜内模拟摆放常规处理物品至使用说明书中规定的最高装载量 (满载)。将试验菌片放于柜室各层中央和四角的物品中间，每层共放置 5 袋。放入试验菌片前，按使用方法，做预湿处理。柜室容量小者可适当减少放置菌片数量。

（3）菌片布放完以后，关闭柜门，进行微波照射。至预定时间，停止照射，打开柜门，取出物品和试验菌片。

（4）消毒试验时，按 2.1.1.7 要求的方法，作定量杀菌效果的检测。灭菌试验时，将取出的试验菌片移种于营养肉汤中，置温箱内作定性培养( 37℃ )。培养 7d，若仍无菌生长，判为阴性。对难以判断的肉汤管，取其中 0.2 ml 悬液接种营养琼脂平板，用灭菌 L 棒涂匀，置 37℃ 培养箱培养。48 h 后涂片染色显微镜下观察菌落形态，或进一步做其他试验，判断生长的是否为试验菌。若为非试验菌，应重新进行试验。  

（5）测试中，应同时设立定性和定量阳性对照组(菌片对照)与阴性对照组(培养基对照)。

（6）定量阳性对照组，将同批试验用的菌片放在室温下，待消毒或灭菌试验组达规定作用时间后，立即将该菌片 2 片分别移入含 5.0ml PBS 试管中，各振荡 80次。取洗液按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。

（7）定性阳性对照组，将同批试验用的菌片放在室温下，待灭菌试验组达规定作用时间后，立即将该批试验用的菌片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，放入培养箱中作定性培养，观察细菌生长情况。

（8）阴性对照组，在灭菌试验中，将同批试验用的菌片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，同时将未接种过的营养肉汤培养基放入培养箱中作定性培养，观察有无细菌生长。在消毒试验中，则应对所用中和剂、稀释液和培养基进行无菌检测，观察有无细菌污染。

（9）试验重复5次。

（10）在5次试验中，阳性对照组各次试验样片的回收菌量均应在5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性阳性对照组，细菌生长良好；阴性对照组样本应无菌生长。阳性或阴性对照若有不符合上述要求的结果，试验作废，重新进行。

2.1.5.3.4 评价规定

（1）在5次消毒试验中，每次试验中的阳性对照菌片，检测回收菌量均应达5×105cfu/片～5 × 106cfu/ 片，阴性对照组应无菌生长，各次试验的杀灭对数值均≥3.00。可判为消毒合格。

（2）在5次灭菌试验中，每次试验中的定量阳性对照组，检测回收菌量均达5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性阳性对照组，细菌生长良好。阴性对照组样本应无菌生长。所有试验菌片都无细菌生长时，可判为灭菌合格。

2.1.5.3.5  注意事项

(1) 微波强弱受电压影响很大。试验时，应注意电压是否符合说明书规定值。波动较大时，应使用稳压电源。

(2) 灭菌柜在消毒棉织品、金属、橡胶管等物品时，一定事先摸索被消毒物品适宜的预湿水量，一方面可防止棉织品烧焦，金属物品对磁控管的破坏；一方面可提高其杀菌效果。

(3) 微波杀菌效果与样本的含水量密切有关。在使用中规定需预湿者，试验时亦必须预湿，不可省略。

(4) 微波消毒金属物品时，需用湿布将其包裹，特别是对金属器械的尖端部分，以防因尖端放电损坏磁控管。

(5) 测试人员长时间受微波照射，对健康有害。试验时必须穿戴专用的防护用具。测试的灭菌柜应先用微波漏能测试仪检测有无微波泄漏。

2.1.5.4  紫外线灯

2.1.5.4.1  目的

测定紫外线灯(包括双灯管组合灯具) 辐照强度及对微生物的杀灭作用，以验证其杀菌性能是否达到合格标准。

2.1.5.4.2  试验器材

(1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢、白色葡萄球菌（8032，空气消毒时用）、等细菌及其芽孢和真菌悬液。

(2) 染菌载体( 10mm ×10mm，以玻片为代表，必要时可随消毒对象，增用或改用其他载体)。

(3) 紫外线照度计(在计量标定有效期内，下简称照度计)。

(4) 紫外线灯测定架(测定时，紫外线灯固定于测定架顶端。顶端高 2 m，可上下移动。下简称测定架)。

(5) 稳压器( 220V )

（6）细菌及其芽孢和真菌杀灭试验所需器材(见 2.1.1.7，2.1.1.9 )。

2.1.5.4.3 辐照强度测定

(1) 将待测紫外线灯管固定于测定架，调节距离使灯管距其下方垂直中心放置照度计处1m。

(2) 开启紫外线灯 5min 后，用照度计在灯管下方垂直距离 1m 的中心处测量其辐照度值  ( μW/cm2 )。

(3) 测量时，电压应稳定在 220V。

(4) 普通型或低臭氧型直管紫外线灯( 30W )，在灯管下方垂直 1m 的中心 处，新灯管的辐照度值应≥90μW/cm2。

(5) 使用中的灯管，可在原装置处进行测定。测定位置仍在灯管下方垂直距离1m 的中心处。使用中灯管的辐照度值应≥70μW/cm2，低于此值者应予更换。

(6) 多灯管组合灯具的测定方法和合格标准，同单支灯管。

(7) 对异型(非直管型)、高强度型，或非 30W 功率等灯管的检测距离和辐照度值合格标准，随产品用途和使用方法而定。原则上，应不低于产品使用说明书注明的辐照度值，并按其推荐剂量[即辐照度值乘以照射时间(s)]进行杀菌试验，证明能满足应用所需效果者可判为实验室测试合格。

(8) 辐照强度检测，每次鉴定抽查 10 支灯管，每支灯管重复测定 3 次。各次数据均达标准可判辐照强度合格。

2.1.5.4.4 细菌及其芽孢和真菌杀灭效果的测定

(1) 按 2.1.1.2所示方法制备细菌及其芽孢和真菌菌片。菌片以玻片为载体。

(2) 试验时，确定菌片照射位置。若无特殊要求，30 W 灯管应在灯管下方垂直距离 1 m 的中心处。

(3) 将菌片平置于无菌平皿中，勿重叠。平皿放于测定架预先确定的照射位置上进行照射。

(4) 照射分为 3 个时间组。各组时间的设置应使能测出将试验细菌及其芽孢和真菌杀灭对数值≥3.00所需的最低剂量，否则应调整时间，重新试验，直至取得所需结果为止。

(5) 将照射后样本送实验室进行活菌培养计数(见 2.1.1.2 )的测定。

(6) 测试中，应同时设立阳性对照组(菌片对照)与阴性对照组(培养基对照)。

(7) 阳性对照组，以试验用的同批菌片置室温下，待试验组消毒完毕后，立即将该批菌片 2 片分别放入含 5.0ml PBS 试管中，电动混匀器震荡20s或各振敲 80次。取洗液按 2.1.1.2 所示方法进行活菌培养计数。

(8) 阴性对照组，以同次实验用培养基或 PBS 接种培养基培养，观察有无细菌生长。

(9)试验重3次。每次试验中的阳性对照菌片，检测回收菌量均应在5×105cfu/片～5×106cfu/片，阴性对照组应无菌生长，各次试验对细菌及其芽孢和真菌的杀灭对数值均≥3.00。该照射时间可判为消毒合格所需照射的时间。阳性或阴性对照组结果若不符上述要求，该次试验作废，重新进行。

(10) 对异型(非直管型)、高强度型，或非 30W 功率等灯管的照射距离，随产品用途和使用方法而定。

2.1.5.4.5评价规定

在3次消毒试验中，对细菌及其芽孢和真菌，每次试验中的阳性对照菌片，检测回收菌量均应达5 × 105cfu/片～5 × 106cfu/ 片，阴性对照应无菌生长，各次试验的杀灭对数值均≥3。可判为消毒合格。

2.1.5.4.6  臭氧产生量的测定

紫外线灯产生的臭氧量不同可影响杀菌效果和使用的安全，故应测定臭氧浓度以便进行综合考虑。臭氧浓度测定方法见本规范理化鉴定技术。检测条件应以产品使用说明中规定的使用方法、面积 (或容积)和时间为准，进行现场(或模拟现场)测定。臭氧浓度应写明于使用说明书中，低臭氧紫外线灯产生的臭氧浓度，应不超过国家规定的工作场所安全浓度( 0.3mg/m3 )。

2.1.5.4.7  有效使用期的测定

将灯管装设于测试架上，通电连续照射。每周测试一次辐照度值，直至低于 70μW/cm2 时为止。该样本连续照射的时间 ( h )，即为其有效使用时间 ( h )。随机抽样，重复测试 5 支灯管，取其最低值。

2.1.5.4.8  注意事项 

(1) 测试前应先用酒精棉球擦除灯管上的灰尘和油垢，以免影响紫外线的照射强度。

(2) 杀菌试验时，应使紫外线直接照射拟消毒表面，否则不能反映该剂量真实的杀菌效果。

(3) 在紫外线灯下工作时，勿直视灯管，并穿戴防护眼镜、防护服、手套等，以减少对测试人员的伤害。在有人工作环境中，空气中臭氧浓度不得超过 0.3mg/m3。

(4) 测定辐照度值或进行杀菌试验时，应保持室内洁净无尘。

2.1.5.5 紫外线消毒箱

2.1.5.5.1  目的

测定紫外线消毒箱(下简称消毒箱) 对物体表面微生物的杀灭效果，以验证其杀菌性能是否符合原设计规定。

2.1.5.5.2  试验器材

（1）金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢、白色念珠菌( ATCC 10231 )、龟分枝杆菌脓肿亚种（ATCC93326）等悬液和脊髓灰质炎病毒悬液。

（2）染菌载体( 10mm × 10mm，以玻片为代表，必要时可随消毒对象，增用或改用其他载体)。

（3）紫外线照度计(在计量标定有效期内，下简称照度计)。

（4）紫外线灯测定架[见 2.1.5.4.2(3)]

（5）细菌及其芽孢、龟分枝杆菌和真菌杀灭试验所需器材(见 2.1.1.7，2.1.1.8，2.1.1.9)。

（6）脊髓灰质炎病毒灭活试验所需试液、培养基和器材（见2.1.1.10）

（7）使用说明书中规定消毒箱可处理的物品(装放于消毒箱，使达满载要求)。

2.1.5.5.3  紫外线照射强度测定

打开消毒箱的盖或门，将内装紫外线灯管取下，在紫外线灯测定架上按 2.1.6.4 测定其照射强度的辐照度值，以确定是否与产品质量标准或企业标准中规定的相同。必要时，以与箱门(或盖) 一样大小的铝板，用胶带固定于消毒箱的门框(或消毒箱盖)上。铝板中央处钻一直径为 15mm 小圆孔，开启箱内紫外线灯，照射 5min，待稳定后，通过铝板上小圆孔用照度计测定射出紫外线的辐照度值( μW/cm2 )。

2.1.5.5.4 对微生物杀灭效果的测定

（1）细菌及其芽孢、龟分枝杆菌和真菌杀灭效果的测定

①按 2.1.1.2 所示相关方法制备细菌及其芽孢和真菌菌片。菌片以玻片为载体。

②每次试验只测试一种微生物，以防交叉污染。试验用样片每 2 片为一组，平放于无菌平皿中，勿重叠。箱内容积过小时，可将试验细菌及其芽孢和真菌直接涂染于所设计消毒的物品表面进行试验，每 2 件为一组。

③根据消毒箱容积的大小，放入一定数量装有样片的平皿，或直接涂染的样本，但消毒箱内应同时将所设计消毒的物品摆放至使用说明书中规定的最高装载量(满载)。

④关闭消毒箱门(或盖)，打开紫外线灯，照射至规定时间。

⑤取出样本，按 2.1.1.3 所示方法进行活菌计数。对白色念珠菌的杀灭试验，用沙堡琼脂培养基，对黑曲霉菌的杀灭试验，用胰蛋白胨琼脂培养基，其他方法和步骤均与细菌杀灭试验相同。

⑥阳性对照组，以试验用的同批菌片置室温下，待试验组菌片消毒达规定作用时间后，立即将该批菌片 2 片分别放入含 5.0ml PBS 试管中，各振荡 80 下。取样液按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。

⑦阴性对照组，用同批次试验用培养基或 PBS 接种培养基培养，观察有无细菌生长。

⑧试验重复3次。阳性对照菌片每次试验回收的含菌量均应在5×105cfu/片～5×106cfu/片，阴性对照组样本应无菌生长，各次试验对细菌及其芽孢和真菌的杀灭对数值均≥3.00。该照射时间可判为消毒合格所需照射的时间。阳性或阴性对照组结果若不符上述要求，该次试验作废，重新进行。

（2）脊髓灰质炎病毒灭活试验

①按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求，用玻片为载体。

②每次试验2片脊髓灰质炎病毒样片为一组，平放于无菌平皿中，勿重叠。箱内容积过小时，可将脊髓灰质炎病毒直接涂染于所设计消毒的物品表面进行试验，每2件为一组。

③根据消毒箱容积的大小，放入一定数量装有样片的平皿，或直接涂染的样本，但消毒箱箱内应同时将所设计消毒的物品摆放至使用说明书中规定的最高装载量(满载)。

④关闭消毒箱的门(或盖)，打开紫外线灯，照射至规定时间。

⑤将照射后将脊髓灰质炎病毒样片移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒的滴度。

⑥将未消毒的脊髓灰质炎病毒样片2片，放置于消毒箱外室温下。待试验组消毒完毕后，立即将脊髓灰质炎病毒样片移入含1ml 细胞维持液的试管中。振荡后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒的感染滴度，作为阳性对照。

⑦阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培养基有无污染，细胞是否生长良好。

⑧试验重复3次。

⑨根据各组的平均病毒的感染滴度（TCID50 ），分别计算其对病毒的灭活对数值。

（3）评价规定

在3次消毒试验中，对细菌及其芽孢和真菌，每次试验中的阳性对照菌片，检测回收菌量均应达 5 × 105 cfu/片～5 × 106 cfu/ 片，阴性对照组样本应无菌生长，各次试验的杀灭对数值均≥3.00。对脊髓灰质炎病毒，培养基无污染，细胞生长良好，脊髓灰质炎病毒的感染滴度（TCID50 ）≥105，灭活对数值≥4.00。可判为消毒合格。

2.1.5.5.5  注意事项

(1) 试验时，应注意箱内物品有无未被紫外线直接照到处(如被箱内支架遮挡)。如实用中拟消毒物品有可能处于该位置，在染菌样片布点时应考虑观察该部位的消毒效果。

(2) 其他同2.1.5.4.6。

2.1.5.6  环氧乙烷灭菌器

2.1.5.6.1  目的

测定环氧乙烷灭菌器 (下简称灭菌器) 对细菌芽孢的杀灭能力，以验证其灭菌性能是否符合原设计规定。

2.1.5.6.2  试验器材

(1) 枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢菌片。

含菌量要求为 5 ×105cfu/片～ 5 × 106cfu/片(按活菌培养计数结果计)。在环氧乙烷量为 600mg/L±30mg/L，温度为 54℃±2℃，相对湿度为 60%±10% 条件下，菌片上芽孢存活时间应 ≥7.8min，杀灭时间≤58min，D值为2.6min～5.8min。

(2) 染菌载体( 10mm × 10mm ，以布片为代表，必要时可随灭菌对象，增用或改用其他载体。

(3) 聚乙烯塑料袋( 封装菌片用，大小为 60mm × 40mm ，厚 0.2min～0.4mm )。

(4) 活菌培养计数所需器材(见 2.1.1.3 )。

(5) 使用说明书中规定灭菌器可处理的物品(装填灭菌器，使达满载要求)。

2.1.5.6.3  灭菌试验操作程序

(1) 根据试验要求，制备枯草杆菌黑色变种芽孢悬液和菌片。菌片放入双层聚乙烯塑料袋内密封包装，每袋2片。每次试验用20袋。

(2) 将灭菌器上、中、下3层，每层内、中、外各设一点，共设9点。每点物品中间布放1袋，共需18袋试验菌片。另将一袋（2片）菌片放置在室温条件下作为阳性对照。

(3) 按使用说明书所规定的环氧乙烷浓度、作用时间、柜内的温度和相对湿度，在满载条件下进行环氧乙烷灭菌处理。满载用物品，随灭菌器用途而定。处理完毕，取出菌片，分别移种于5 ml 营养肉汤培养基中，置37℃ 培养箱内培养，7d后观察最终结果(定性培养检测)。

对难以判断结果的营养肉汤管，取其中0.2ml悬液接种营养琼脂平板，用无菌L棒涂抹均匀，置37℃ 培养箱内培养。48h后涂片染色，显微镜下观察菌落形态，或进一步做其他试验，判断有无生长或生长的是否为试验菌。若为非试验菌，则应重新进行试验。

(4) 测试中，应同时设立定性和定量阳性对照组与阴性对照组。

(5) 定量阳性对照组，以同批试验用菌片置室温下，待消毒或灭菌试验组达规定作用时间后，立即将该菌片2片分别放入含5.0ml PBS试管中，各振敲打80次。取洗液按2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。

(6) 定性阳性对照组，以同批试验用菌片置室温下，待灭菌试验组达规定作用时间后，立即将该菌片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，放入温箱中作定性培养，观察有细菌生长情况。

(7) 阴性对照组，以同批次试验用未染菌样片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，同时将未接种过的营养肉汤培养基放入培养箱中作定性培养，观察有无细菌生长。

(8) 试验重复 5 次。

(9)在5次试验中，每次试验中的阳性对照菌片，回收菌量均应在5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性阳性对照组，细菌生长良好；阴性对照应无菌生长。阳性或阴性对照若有不符合上述要求的结果，试验作废，重新进行。

2.1.5.6.5  评价规定

在 5 次灭菌试验中，每次试验中的定量阳性对照组，检测回收菌量均达 5 × 105 cfu/ 片～5 × 106cfu/ 片； 定性阳性对照组，细菌生长良好。阴性对照应无菌生长。所有试验菌片全部无细菌生长时，可判为灭菌合格。

2.1.5.6.6  注意事项

(1) 温度和相对湿度对环氧乙烷气体杀菌效果影响较大，故应严格控制试验中的有关条件。

(2) 环氧乙烷液体可溶解聚乙烯、聚氯乙烯等，不可将其液体滴落于此类物品上。环氧乙烷不论液体或气体，均可损坏赛璐璐制品，试验时应予注意。

(3) 环氧乙烷易燃易爆，操作现场应采取防火防爆措施，不得有明火作业及电火花发生。

(4)吸入过多环氧乙烷气体，可引起头痛，呕吐等中毒症状，严重者可致肺水肿等。工作环境中应有良好的通风。在每日 8h 工作中，环氧乙烷浓度应不超过1.82mg/m3 （1ppm），15min 工作中暴露浓度不超过9.1mg/m3（5.0ppm）。如出现中毒症状，需迅速离开现场。轻者呼吸新鲜空气，直到症状消除；重者应及时送医院治疗。

2.1.5.7  臭氧消毒柜

2.1.5.7.1  目  的

测定臭氧消毒柜(下简称消毒柜)对物体表面上微生物的杀灭效果，以验证其杀菌性能是否符合原设计规定。

2.1.5.7.2  试验器材

(1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )悬液和脊髓灰质炎病毒悬液。

(2) 染菌载体(10mm × 10mm，以布片或玻璃片为代表，必要时可随消毒对象，增用或改用其他载体)。

(3) 臭氧采样装置和浓度分析仪。

(4) 细菌定量杀灭试验用器材( 见 2.1.1.7，2.1.1.9 )。

(5) 脊髓灰质炎病毒灭活试验用试液、培养基和器材(见 2.1.1.10 )。

(6) 温度与湿度计。

2.1.5.7.3  臭氧浓度测定

(1) 仪器测定:臭氧浓度可用臭氧分析仪测定。操作按仪器使用说明书规定进行。

(2) 化学滴定法测定:参考本规范理化鉴定实验技术。

2.1.5.7.4 杀灭微生物试验操作程序

臭氧消毒柜的臭氧发生器臭氧发生量一般不可调，故试验时设 3 个作用时间组［时间分组见2.1.1.7.3（1）］。

（1）细菌和真菌杀灭试验

①按 2.1.1.2 所示相关方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要时，可增设其他试验微生物。

②因臭氧在柜内扩散慢，分布不易均匀，故物品在柜内应摆放至使用说明书中规定的最高装载量(满载)，以尽量接近实际应用时的情况。

③以 2 片菌片一组，置一无菌平皿中，勿重叠。试验时，将放有菌片的平皿盖打开，分层布放，每层内、中、外各点分别放一组样本。

④按照使用说明书要求，调节柜内温度与相对湿度，并记录备查，然后开启臭氧发生器进行消毒。

⑤消毒至规定时间，取出菌片，按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。对白色念珠菌的杀灭试验，用沙堡琼脂培养基，对黑曲霉菌的杀灭试验，用麦芽浸膏琼脂培养基，其他方法和步骤均与细菌杀灭试验相同。因臭氧气体熏蒸，载体吸收的量少、分解快，可不必进行去除残留臭氧的处理。每组试验重复 3 次。

⑥将未消毒的菌片2片，放置于消毒碗柜外室温下。待试验组消毒完毕后，同时进行活菌培养计数检测。取本次试验同批的 PBS 接种培养基培养，作为阴性对照。

[对未固定装于消毒箱内的臭氧发生器(如冰箱臭氧消毒器)，其杀菌效果鉴定，可按其用途，在相应的密闭柜内进行。柜的大小应与所设计的杀菌有效范围相近]。

（2）脊髓灰质炎病毒灭活试验

①按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求，用玻片为载体。

②在消毒碗柜满载的情况下，将干燥的染有脊髓灰质炎病毒的载体置灭菌平皿内，每平皿放 2 片，勿重叠。在消毒碗柜每层的内、外两个点各放一含染有脊髓灰质炎病毒载体的平皿(大型碗柜可在内、中、外各放一平皿)，平皿盖打开。

③关闭柜门，开启电源，按原规定程序进行消毒。消毒完毕，按说明书规定的时间，打开柜门，取出平皿。将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度。

④将未消毒的染有脊髓灰质炎病毒的载体 2 片，放置于消毒碗柜外室温下。待试验组消毒完毕后，立即将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度，作为阳性对照。

⑤阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培养基有无污染，细胞是否生长良好。

⑥试验重复 3 次。

⑦根据各组的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分别计算其对病毒的灭活对数值。

2.1.5.7.5  评价规定

对细菌及其芽孢和真菌，在3次试验中，所设阳性对照组回收菌量在5×105cfu/片～5×106cfu/片，阴性对照无菌生长，试验组中每次试验细菌及其芽孢和真菌的杀灭对数值均≥3；对脊髓灰质炎病毒，在 3 次试验中，所设阳性对照组，脊髓灰质炎病毒滴度达 105 (TCID50)，阴性对照细胞无污染，试验组中每次试验病毒滴度下降 4 个对数值者，该组作用时间可作为实验室试验消毒合格的最短作用时间。

若阳性或阴性对照组的结果与上述要求不符，试验作废，重新进行。

2.1.5.7.6  注意事项

(1) 对试验结果有怀疑时，可在试验时同步进行臭氧浓度测定，以便作进一步的分析。

(2) 每次试验完毕，应充分排除消毒柜内的臭氧气体，勿使有臭氧残留，以免影响随后的试验。

(3) 空气中 臭氧 浓度不得超过 0.3mg/m3，臭氧吸入过多，可使人中毒，试验场所应保持通风良好。

(4) 温度和相对湿度均可影响臭氧气体对细菌的杀灭效果，试验时必须控制好这些条件，使其前后一致。

2.1.5.8臭氧水消毒器

2.1.5.8.1 目的

检测臭氧水消毒器发生的臭氧水消毒剂对物品表面的消毒效果，以验证臭氧水消毒剂对物品表面消毒的实用剂量。

臭氧水消毒剂指应用臭氧消毒设备制备的含臭氧的水溶液，并以其作为消毒剂，用于对物品表面等的消毒。

2.1.5.8.2  试验器材

(1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )悬液和脊髓灰质炎病毒悬液。

(2) 染菌载体(10mm×10mm，以布片为代表，必要时可随消毒对象，增用或改用其他载体)。

(3) 臭氧采样装置。

(4) 细菌定量杀灭试验用器材与培养基(见 2.1.1.7，2.1.1.9 )。

(5) 脊髓灰质炎病毒灭活试验用试液、培养基和器材(见 2.1.1.10 )。

(6) 温度与湿度计。

(7) 500 ml塑料杯。

(8) 水流量计（1L/min～10L/min）。

(9) 不锈钢网。

(10) 臭氧浓度测定用臭氧分析仪和化学滴定法用试剂、器材等。

2.1.5.8.3 臭氧浓度测定

臭氧浓度的测定方法分为化学滴定法和仪器测定法。

仪器测定法按仪器使用说明书要求进行。

（1）通过式臭氧消毒设备

测定水样流出消毒设备后臭氧浓度由高到低的衰变曲线。测定时，若出水流量可调，设 3 个流量其中应包括该设备的最大流量和最小流量，若出水流量不可调，则按说明书要求设 1 个流量，各流量水样流出消毒设备后，即刻测定水样中臭氧含量，然后再将水样放 20℃ 水浴中，设 5个～6个时间段，分别测定水样中臭氧含量，并绘制臭氧浓度衰变曲线。

（2）暴气式臭氧消毒设备

测定一定容量的水体中臭氧浓度由低到高，直到臭氧浓度达饱和时的浓度变化曲线。按说明书要求，加入规定容量的水样，通入臭氧气体，设 5个～6个时间段（应测出臭氧浓度达饱和时的最短时间），分别测定水样中臭氧含量，并绘制臭氧浓度变化曲线。

2.1.5.8.4 杀灭微生物试验操作程序

按臭氧设备制备臭氧水消毒剂的方式分为暴气式与通过式两类。

（1）暴气方式臭氧消毒设备制备臭氧水消毒剂的杀灭微生物试验

①按 2.1.1.2 所示相关方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌黑色变种芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要时，可增设其他试验微生物。    

②有专用容器者，按说明书要求向专用容器内加入规定容量的无菌蒸馏水无专用容器者，用容量≥3000ml的烧杯，盛装3000ml无菌蒸馏水样，调水温至20℃±2℃

若无专用容器但需在更大容量的水样中进行试验者，示消毒设备状况，按使用说明书要求调整水样用量，并调水温至20℃±2℃。

③将不锈钢网放盛水容器底部中央，染菌布片放不锈钢网表面，染菌布片上再盖一不锈钢网片。

④连接微孔扩散装置与臭氧气源出口，开启臭氧消毒设备，开始消毒处理。

⑤待臭氧暴气浸泡消毒至规定作用时间（第一个作用时间应不少于水中臭氧达饱和浓度所需时间），取出样片，移入含5 ml中和剂溶液的试管中，中和10 min，进行活菌计菌。

⑥试验同时设阳性对照和阴性对照组，阳性对照用无臭氧气体代替臭氧气体，在水样体积和暴气量等相同条件下，将染菌样片暴气浸泡至最长作用时间，取出样片，进行活菌计数。

⑦试验重复3次。

⑧根据各组杀灭对数值计算结果，确定杀灭细菌繁殖体，真菌或细菌芽孢的杀灭对数值为3所需最低有效浓度和相应的作用时间。

（2）通过式臭氧消毒设备制备的臭氧水消毒剂流动载体浸泡杀灭微生物试验

①按 2.1.1.2 所示相关方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌黑色变种芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要时，可增设其他试验微生物。    

②将臭氧水消毒设备开机5min，使臭氧水中臭氧含量稳定。

③取不锈钢网放盛水容器底部中央，染菌布片放不锈钢网表面，染菌布片上再盖一不锈钢网片。用臭氧水消毒剂沿容器壁流下，流动浸泡消毒至说明书规定作用时间，取样检验。

④试验同时设阳性和阴性对照。阳性对照组用自来水代替臭氧水消毒剂，在相同流量下流动浸泡至最长作用时间。取出样片，进行活菌计数。

⑤取本次试验同批的 PBS 和培养基接种培养基培养，作为阴性对照。

⑥试验重复3次。

⑦根据各组杀灭率计算结果，确定杀灭细菌繁殖体、真菌或细菌芽孢的杀灭对数值为3所需最低有效浓度和相应的作用时间。

2.1.5.8.5 脊髓灰质炎病毒灭活试验

(1) 按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求，用玻片为载体。

(2) 将制备的脊髓灰质炎病毒玻片加到无菌试管中，使带有病毒的一面向上。

(3) 将臭氧水消毒设备开机5min，使臭氧水中臭氧含量稳定。

(4) 向含有脊髓灰质炎病毒玻片的试管中加入1.0ml的臭氧水消毒剂，浸泡消毒至规定作用时间，取出玻片载体，移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度。

(5)将未消毒的染有脊髓灰质炎病毒的玻片，加到1.0ml的无菌蒸馏水中，浸泡至规定消毒作用的最长时间。取出玻片载体，移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度，作为阳性对照。

（6）阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培养基有无污染，细胞是否生长良好。

(7) 试验重复 3 次。

(8) 根据各组的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分别计算其对病毒的灭活对数值。

2.1.5.8.6  评价规定

对细菌及其芽孢和真菌，在3次试验中，所设阳性对照组的回收菌量在5 × 105cfu/片～5 × 106 cfu/片，阴性对照无菌生长，试验组中每次试验细菌及其芽孢和真菌的杀灭对数值均≥3.00；对脊髓灰质炎病毒，在3次试验中，所设阳性对照组，脊髓灰质炎病毒滴度达105 (TCID50)，阴性对照细胞无污染，试验组中每次试验病毒滴度下降4个对数值者，该组作用时间可作为实验室试验消毒合格的最短作用时间。

若阳性或阴性对照组的结果与上述要求不符，试验作废，重新进行。

2.1.5.8.7  注意事项

对试验结果有怀疑时，可在试验时同步进行臭氧浓度测定，以便作进一步的分析。

2.1.6 灭菌与消毒指示器材鉴定试验

2.1.6.1 压力蒸汽灭菌生物指示物鉴定试验

2.1.6.1.1 目  的

测定压力蒸汽灭菌生物指示物所含菌量，以及在121℃±0.5℃饱和蒸汽作用下的存活时间、杀灭时间与 D 值是否达到要求指标。

2.1.6.1.2  实验器材

(1) 压力蒸汽灭菌生物指示器材抗力检测器 (biological indicator evaluator resistometer，pressured steam sterilization，BIER，下简称抗力检测器)。对抗力检测器要求的技术指标：时间控制以秒为单位；温度控制以0.1℃为单位；加热至预定温度的时间应≤10s；排气时间≤5s；试验期间柜室内温度误差≤±0.5℃。

(2) 56℃～60℃ 温箱。

(3) 溴甲酚紫蛋白胨培养液 (嗜热脂肪杆菌芽胞恢复培养基，见附录A)。

(4) 嗜热脂肪杆菌芽胞恢复琼脂培养基 (见附录A)。

(5) 眼科镊子 (夹取菌片用)。

(6) 磷酸盐缓冲液 (PBS，0.03 mol/L，pH 7.2)。

(7) 回收液 (含 0.1% 吐温 80 的 PBS 液)。

2.1.6.1.3 生物指示物微生物含量与抗力标准

(1) 嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus ATCC 7953或SSI K31) 芽孢。回收菌量为5×105cfu/片～5×106cfu/片，或5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。

(2) 在121℃±0.5℃ 饱和蒸汽条件下，存活时间≥3.9min，杀灭时间≤19min。

(3) 在121℃±0.5℃ 饱和蒸汽条件下，D值为1.3min～1.9min。

2.1.6.1.4  生物指示物含菌量的测定

随机抽取3个生物指示物样本。样本如为菌悬液式指示物，直接用 PBS 作适当稀释后，按2.1.1.3 规定进行活菌培养计数即可；样本如为含菌载体式指示物 (如菌片)，应先置回收液中洗下芽孢，并以PBS稀释至适当浓度，再进行活菌计数培养。培养温度为56℃～60℃，24h 观察结果。培养基仍用营养琼脂培养基。检测菌量符合2.1.6.1.3者为合格。

2.1.6.1.5 存活时间和杀灭时间的测定

下以生物指示管的测定为例：

(1) 试验按作用时间分为 3.9min 和 19min 两组，各组测定20个样本。

(2) 先将抗力检测器的电热蒸汽发生器加满蒸馏水，以不超过最高水位为度。

(3) 接通检测器电源，预热，使达到预定蒸汽压。

(4) 设定灭菌温度(121℃±0.5℃)和作用时间。

(5) 启动抗力检测器工作程序，使自动运行两个循环，以保证柜室等得到充分的预热。

(6) 将生物指示管 (每批放 20个样本) 放专用载物架上并置抗力检测器柜室中，保证每个样本都可充分暴露于蒸汽中。

(7) 关闭柜门，先设定一组所规定的灭菌时间。

(8) 启动抗力检测器工作程序，使自动进行抽真空→柜室加热→灭菌处理→排气。

(9) 打开柜门，取出生物指示管。

(10) 紧接着重复 (5)～(9) 的程序进行另一组的测定。

(11) 取出的生物指示管应尽快 (勿超过 2h) 放入 56℃～60℃ 温箱，培养 7d，观察最终结果。

(12) 测定结果，3.9min 组(存活时间组)20个生物指示管均有菌生长；19min 组(杀灭时间组)20个生物指示管均无菌生长时，可判为合格。其中一个组或两组各有一个样本未达规定要求，可再用4组样本重复试验(3.9min和19min组各测试2次)。重复试验中，如各样本均达规定要求，仍可认为合格。

[ 对生物指示菌片测定时，操作程序与判断标准与上述生物指示管基本相同，只是将单片菌片装于牛皮纸袋中，以防灭菌时被冷凝水浸湿。此外灭菌完毕，需将样本分别接种于溴甲酚紫蛋白胨培养液中培养，7d 观察最终结果]。

2.1.6.1.6  D 值的测定

(1) 随机抽取 50个样本，在 0min～20min 范围内分成 10个作用时间组进行试验。每组 5个样本。作用时间递增幅度，可根据预备试验结果适当变动(最长时间必须达到使菌全部死亡的作用时间)。

(2) 将各组样本按 2.1.6.1.5 (2)～(10) 所示程序，分次进行灭菌处理。

(3) 灭菌完毕，按 2.1.6.1.4 所示对各组样本随机抽取3个进行活菌培养计数。

(4) 计算每个作用时间样本上平均存活芽孢数的对数值。以作用时间为横坐标(X)，存活芽孢数的对数值为纵坐标(Y)，算出芽孢存活与作用时间的回归方程(Y = a + bX)。

(5) 计算各实际测定值与直线回归方程的相关程度(相关系数)。

(6) 根据所得直线回归方程式，计算出减少90%芽孢数所需的作用时间(D 值)。D值符合2.1.6.1.3 者为合格。

2.1.6.1.7  稳定性试验

(1) 在规定的贮存条件下，存放足量产品。

(2) 按使用说明书规定的有效期限抽样检测，先观察外观，特别注意指示剂中的培养液颜色有无变化。

(3) 在外观正常情况下，进一步按 2.1.6.1.4、2.1.6.1.5 所示方法测定活菌数量、存活时间、杀灭时间。菌量数下降＜50%，存活时间和杀灭时间又在规定合格范围内(见 2.1.6.1.3)者，该贮存期可视为产品的有效保存期。

2.1.6.1.8  注意事项

(1) 测定生物指示剂的抗力时，必须用压力蒸汽灭菌生物指示剂检测器进行，不能用普通压力蒸汽灭菌器代替。

(2) 使用抗力检测器进行测定时，为确保每次加热时间的一致，每次间隔时间不宜超过100s。如时间过长，柜室必须重新预热。

(3) 培养基性能对热损伤后的芽孢恢复有一定影响，试验时不能用普通培养基代替恢复培养基。

(4) 严格无菌操作，尤其是对生物指示菌片进行存活和杀灭时间测定时。

2.1.6.2  压力蒸汽灭菌化学指示卡鉴定试验

2.1.6.2.1  目  的

测定下排气式、预真空式和脉动真空式压力蒸汽灭菌化学指示卡(下简称化学指示卡)产品在饱和蒸汽作用下所产生的颜色变化，与拟代表的温度、杀菌作用时间的吻合情况，以作为判断该指示卡是否合格的依据。对其他相似类型化学指示物的鉴定，可参照本试验的有关原则进行。

2.1.6.2.2 实验器材

(1) 压力蒸汽灭菌生物指示物抗力检测器 [见 2.1.6.1.2 (1)，下简称抗力检测器]。

(2) 生物指示物 (经鉴定合格者，见 2.1.6.1)。

(3) 留点温度计 (60℃～140℃，应经检定合格)。

2.1.6.2.3  试验分组

试验根据作用温度和时间分组，一般情况下，以使用说明书表明的变色温度和作用时间为第1组，而后温度不变，作用时间缩短10min为第2组；另外，作用时间不变，仍为20 min，温度下降4℃为第3组。预真空和脉动真空式压力蒸汽灭菌，因所需作用时间很短，故第2组只降低2min即可。

例如，某一下排气式压力蒸汽灭菌化学指示卡使用说明书写明，在温度为 121℃，作用 20 min 可全部达到变色完全 (与标准合格色块相同)。对该指示卡鉴定试验时，可分组如下:

第 1 组  121℃，20min；

第 2 组  121℃，10min；

第 3 组  117℃，20min。

又如，某一预真空式压力蒸汽灭菌化学指示卡使用说明书写明，在温度为 132℃，作用 3min 可全部达到变色完全。对该指示卡鉴定试验时，可分组如下:

第 1 组  132℃，3min；

第 2 组  132℃，1min；

第 3 组  128℃，3min。

[分组测试的目的是：① 验证使用说明书所表明的温度和作用时间，能否使指示卡变色完全；②测试灭菌不完全的温度或时间条件下，化学指示变色不完全 (未达到与标准合格色块深度相同) 的比例]。

2.1.6.2.4  实验室试验操作程序

(1) 每组试验，取 10 片化学指示卡、1 件生物指示器材和 1 支留点温度计，同时放入抗力检测器中。

(2) 操作抗力检测器，将各组样本按 2.1.6.1.5 (2)～(10) 所示程序分次进行处理 (各试验组要求的温度和作用时间，见 2.1.6.2.3)。

(3) 立即打开柜门，取出上述物品，进行检测。

(4) 检测时，观察留点温度计所示温度；对比化学指示卡上变色色块与标准合格色块的颜色，确认是否达到合格要求；将生物指示物放入 56℃ 温箱中培养 7d，并观察是否有菌生长。

(5) 系统记录各组留点温度计、化学指示卡和生物指示物的结果。

(6) 各组试验均重复 3 次。

(7) 3 次测定结果均符合以下全部情况者可判为合格： ① 第 1 组指示卡 100% 变色完全，第 2 组与第 3 组指示卡 ≤20% 变色完全； ②各组生物指示物结果与指示卡基本同步；③ 留点温度计读数与试验规定的温度，相差不超过 ±0.5℃。

2.1.6.2.5  稳定性试验

取包装完好并在室温、避光、干燥条件下，保存至一定时间 (至少半年) 的化学指示卡，用实验室试验(2.1.6.2.4) 方法进行检测。若结果符合上述要求，可视为指示卡在该保存期内性能稳定。

2.1.6.2.6 注意事项

(1) 化学指示卡的鉴定，除注意其在到达灭菌要求温度和时间时可变为合格颜色外，还必须观察其在未达到灭菌要求温度和时间时是否不会变成合格颜色。从防止灭菌不合格角度看，后者更为重要。因此，在试验中低于灭菌要求温度和时间组绝不可省略。

(2) 测定时应使用饱和蒸汽，否则可影响结果的准确性。

(3) 留点温度计检定时所观测到的误差，在记录试验温度时，应将读数校正。

(4) 压力蒸汽灭菌生物指示物抗力检测器为一专用设备，国外和我国均有生产。由于试验要求的精密度较高，不宜用一般压力蒸汽灭菌器代替。

(5) 试验中所用化学指示卡和生物指示物必须为同批产品。

(6) 下排气式和预真空 (包括脉动真空) 式压力蒸汽灭菌对温度和作用时间的精确度要求不同，故在两类化学指示卡试验分组中温度和作用时间的组距亦不同，两者不宜混用。

(7) 对所要求的重复性试验，不可只在同次试验中增加一些化学指示卡，而应每重复一次试验即应进行一次压力蒸汽灭菌处理，以防产生系统性误差。

2.1.6.3   压力蒸汽灭菌化学指示胶带与化学指示标签的鉴定试验

2.1.6.3.1 目  的

测定压力蒸汽灭菌用化学指示胶带与化学指示标签在规定温度的饱和蒸汽和作用时间下的变色情况，以作为判断该指示胶带和标签是否适用于作为经压力蒸汽灭菌处理标志的依据。

2.1.6.3.2  实验器材

(1) 下排气式压力蒸汽灭菌器与预真空或脉动真空压力蒸汽灭菌器。

(2) 留点温度计 (60℃～140℃，经鉴定合格)。

2.1.6.3.3  试验分组

试验根据作用温度和时间分组，一般情况下化学指示胶带和标签所要求的准确度较化学指示卡类产品为宽松。分组时，以使用说明书表明的变色温度和作用时间为第 1 组；而后，温度不变，作用时间缩短10min 为第 2 组 ；另外，时间不变，温度下降 10℃ 为第 3 组。

预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌，因所需时间很短，故第 2 组缩短至 1min 即可。

例如，使用说明书表明，某种用于下排气式压力蒸汽灭菌的化学指示胶带，在温度为121℃，作用 20 min 可全部达到变色完全 (与标准合格色块相同)。试验时，可分组如下：

第 1 组  121℃，20min；

第 2 组  121℃，10min；

第 3 组  111℃，20min。

又如，某一用于预真空与脉动真空式压力蒸汽灭菌的的化学指示胶带，说明书写明，在温度为 132℃，作用 3min  可全部达到变色完全。试验时，可分组如下：

第 1 组  132℃，3min；

第 2 组  132℃，1min；

第 3 组  122℃，3min。

[分组测试的目的是： ① 验证使用说明书所表明的温度和作用时间，能否使样本变色完全；②测试灭菌不完全温度或时间条件下，化学指示胶带与化学指示标签变色不完全 (未达到与标准合格色块深度相同) 的比例]。

2.1.6.3.4  试验操作程序

(1) 每组试验取 5 个标签或来自不同卷的 5 段胶带，粘贴于厚纸片上，随同一留点温度计放入相应的压力蒸汽灭菌器中。

(2) 按常规灭菌方法处理，待达到要求的温度及其相应的压力，持续至规定的时间，排空柜室内蒸汽使成常压。

(3) 打开柜门，取出样本。

(4) 观察、记录化学指示胶带、标签，是否变色和留点温度计显示的温度。

(5) 各组试验重复 3 次。

(6) 3 次试验均符合以下条件者为合格： ① 第 1 组全部样本变色完全，② 第 2 和第 3 组变色完全的样本比例不超过 20%。③ 留点温度计所示温度与设定的温度相差不超过 ±0.5℃。

[对未印有变色完全的标准色块的指示胶带和标签，可依据生产者另外提供的完全变色样本，对变色完全与否进行判断]。

2.1.6.3.5  稳定性试验

取包装完好的样本，在室温、避光、干燥条件下保存至使用说明书规定的有效期限，用2.1.6.3.4 规定的方法进行检测，若结果符合要求，所测指示胶带与标签可视为在该保存期内性能稳定。

2.1.6.3.6  注意事项

(1) 于 121℃ 条件下检测合格者，只能于121℃ 灭菌时使用，于132℃条件下检测合格者，只能于132℃灭菌时使用。只有两组检测均合格者，才能兼用于上述两种温度灭菌的监测。

(2) 其他注意事项见 2.1.6.2.6 中的有关内容。

2.1.6.4  紫外线灯管照射强度化学指示卡鉴定试验

2.1.6.4.1  目  的

测定紫外线灯管照射强度化学指示卡 (下简称指示卡) 在照射后颜色的变化与所受照射剂量的相关情况，从而确定是否可用于使用单位对紫外线灯管照射强度的自检。

2.1.6.4.2 试验器材

(1) 紫外线照度计 (在计量标定有效期内，下简称照度计)。

(2) 低臭氧直管紫外线灯 [30 W，紫外线强度 (辐照度值) ≥90μW/cm2]。

(3) 紫外线灯测定架（附220V稳压器。下简称测定架）。

2.1.6.4.3  试验操作程序

(1) 将紫外线灯装于测定架上，指示卡置灯管下方垂直中心位置的照射台上 (灯管与照射台距离可上下调整，以使达检测时规定的照射强度)。

(2) 开启紫外线灯，待 5 min 后灯管工作稳定，按指示卡上各标准色块注明的强度，分别调整好灯管下照射台中心测试点处的紫外线照射强度 (用照度计测定)，以进行随后的照射试验。

(3) 照射时，在测定架上对指示卡变色区进行照射。每 10 张指示卡为一组，每组照射1min，每个强度照射3组（共 30 张指示卡）。

(4) 照射后，即刻用肉眼观察照射过的指示卡，比较其变色区色块与相应标准色块的颜色。

(5) 同时用照度计测定紫外线照射强度，以与指示卡结果核对。

(6) 变色区色块与标准色块，以及指示卡检测结果与照度计测定结果的符合率均≥90% 者，可判定为合格。

2.1.6.4.4  稳定性试验

(1) 在室温避光条件下，存放足量指示卡。

(2) 按使用说明书规定的期限抽样，每次抽取20 份样本按 2.1.6.4.3 方法进行检测。

(3) 试验结果符合合格要求 [2.1.6.4.3 (6)]，可认为该存放时间即为其贮存有效期。

2.1.6.4.5  注意事项

(1) 为防失准，所用照度计必须定期检测校正，并在计量标定有效期内。

(2) 试验中所用指示卡必须为同一批产品。

(3) 测试时，对指示卡照射1min，时间应准确，过长或过短均可影响结果。

(4) 指示卡测定时，应防紫外线灯光直射。

(5) 光敏指示卡反应变色后，久存可能颜色有所改变，为此检测结果应即时观察并用文字记录。

(6) 测试应分多次进行，否则易发生系统误差。

(7) 电压波动可影响灯管放射的紫外线强度，试验时应予注意。

2.1.6.5  消毒剂浓度试纸鉴定试验

2.1.6.5.1  目 的

通过检测消毒剂浓度试纸 (下简称试纸) 颜色反应情况与溶液中消毒剂浓度相关程度，以作为对其应用做出评价。

2.1.6.5.2  实验器材

消毒剂有效成分化学分析器材。

2.1.6.5.3  测定分组 

鉴定中，应根据试纸使用说明书所列可测试消毒剂种类分别进行测试。测试中，取比色卡上所示标准色块中的高、中、低3个浓度作为3个组。对每种消毒剂，每组浓度测试30个样本 (取自3个以上最小包装)。3组的主要有效成分浓度，均应分别用化学滴定法测定。

2.1.6.5.4  试验操作程序

(1) 配制各种消毒剂的高、中、低 3 组浓度溶液，并按本规范中有关方法测定其主要有效成分浓度。

(2) 对各消毒剂浓度组，分别用试纸浸于溶液中，润湿即取出。半分钟后与标准色块比较，确定所测浓度。每条试纸作为1个样本，逐个样本分别进行测定。

(3) 将试纸测得的浓度与化学滴定法测得的浓度比较，该组样本总符合率≥90% 者为合格。

2.1.6.5.5  稳定性试验

(1) 按说明书要求，在室温存放足量指示卡。

(2) 按使用说明书规定的期限抽样，按 2.1.6.5.4 所示方法进行检测。

(3) 试验结果符合合格要求[2.1.6.5.4 (3)] 者，可认为该存放时间即为其贮存有效期。

2.1.6.5.6  注意事项 

(1) 有效成分不稳定的消毒剂，应在试纸检测后尽快用化学法滴定其浓度。

对于反应后颜色可消退的产品，应及时观察结果，并用文字记录。

2.1.7 灭菌医疗用品包装材料鉴定试验

灭菌医疗用品包装村翻新是指要求最终灭菌（即包装后灭菌）的医疗用品的包装材料。

2.1.7.1 理化性能鉴定

2.1.7.1.1一般检查

（1）在日光或良好的人工光源下检查，包装应无削弱其功能的洞孔、裂缝、撕裂、皱痕或会影响其功能的局部加厚或变薄。

（2）包装内医疗用品应无未经保护的，可能会破坏包装的尖锐边缘或突出物。

2.1.7.1.2 质量测定(可参考ISO 536)

（1）器材

1) 天平：感量2mg，测量精确度0.5%

2) 切割机：切割面积精确度1.0%

（2）操作步骤

1）条件：在温度23℃±1℃，相对湿度50%±2% 条件下进行

2）取样：取5份样品，按每片面积为12500px2（200mm×250mm）制样片，每份样品切4片样片，共20个样片。

3）称量：称取每片样片重量，以g为单位，保留三位有效数字

4）计算：计算平均值与标准差             

质量（g/m2） = m × 10000 / A

式中：m为样片平均质量（g）

A为样片平均面积（cm2）

（3）结果报告：在一定温湿度条件下，每平方米样片的平均重量（g）。

（4）评价：包装材料单位面积的平均质量，应在产品标准的±5% 范围内。纸质材料的平均质量应≥56 g/m2。

（5）注意事项：在制备样片时避免用手直接接触。

2.1.7.1.3 pH值测定(可参考ISO 6588)

（1）器材

1）蒸馏水或去离子水：电导率≤0.1 mS/m

2）标准缓冲溶液：pH值4.0，6.9，9.2

3）pH计：分辩率0.05

4）回流冷凝器

（2）操作步骤

称取样品2 g，精确到0.1 g。粉碎成约5mm×5mm大小，放入带塞细颈玻璃烧瓶内。将100ml蒸馏水加入另一同样带塞细颈玻璃烧瓶内，连接回流冷凝器，将水加热到接近沸腾。 移去冷凝器，将接近沸腾的水加入含有样品的烧瓶内，连接冷凝器慢煮1h。用冷凝器快速冷却至20℃～25℃。让纤维沉淀，并轻轻将抽提液倒入小烧杯内，进行pH测定。

（3）结果报告: 取两次测定结果的平均值。

（4）评价：包装材料水提取物的pH值应在5～8范围内。

2.1.7.1.4氯化物含量测定(可参考ISO 9197-1)

2.1.7.1.5硫酸盐含量测定(可参考ISO 9198)

2.1.7.1.6荧光测定（可参考EN 868-2）

2.1.7.2灭菌因子穿透性能鉴定

(1) 灭菌条件

1) 压力蒸汽灭菌：121 ℃，20min～30min ；134 ℃，2min～6min。

2) 环氧乙烷灭菌：温度54℃，环氧乙烷浓度600mg/L～1000mg/L，作用至预定时间。

3) 辐照灭菌：辐照剂量10 kGy～30 kGy

(2) 操作要求

1) 压力蒸汽灭菌：按GB 18278-2000进行。

2) 环氧乙烷灭菌： 参照2.1.5.6环氧乙烷灭菌效果鉴定试验进行。

3) 辐照灭菌：按GB 18280-2000进行。

(3) 结果报告：包装袋上化学指示色块变色情况及包装内生物指示剂灭菌情况。

(4) 评价：在灭菌条件下，所有化学指示色块均达规定颜色。包装内生物指示剂应无菌生长。

2.1.7.3环氧乙烷残留水平测定(可参考ISO 10993-7)

2.1.7.4对包装标识的影响

(1) 包装及其标识不因灭菌而变色。

(2) 包装标识不因灭菌而变得难以辨认。

2.1.7.5 微生物屏障性能鉴定

2.1.7.5.1包装材料不透气性试验—染色渗透试验

(1)器材

1) 海绵：由醋酸纤维海绵制取，其尺寸为110mm×75mm×32mm，用防水胶粘剂与尺寸为110mm×75mm×12mm的钢板粘结，其总重量控制在800g±50g。

2）平滑玻璃

3）吸纸：白色中快吸滤纸或色层分析纸

4）染色液：1%苋菜红水溶液见附录A

5) 浅盘：深度不小于15mm，最小面积为135 mm×95 mm

6) 样片：面积250mm×105mm

(2)操作步骤

1) 取一块面积与样片相同的吸纸，放在玻璃表面，将待测试料的内表面与吸纸接触。

2) 将染色液倒入浅盘中，使海绵在浅盘内滞留1 min，取出海绵，靠着盘的边把多余的液体挤除。

3) 将海绵放在样片上，保证海绵的边缘在样片边部之内（且距边部不少于15mm），并静置2 min。

4) 取走海绵，检查纸的被污染情况。

(3)结果报告: 报告被沾染的吸收纸的样片数量。

(4)评价：吸收纸上不沾染颜料。

2.1.7.5.2透气性材料微生物屏障试验

(1)湿性条件下微生物屏障性能

1）器材

①试验微生物:金黄色葡萄球（ATCC 6538）

②培养基: 血琼脂、营养琼脂、葡萄糖营养肉汤

③真空干燥箱：100 mbar

④样片：面积50mm×50mm

2）操作步骤

①将样片于134℃压力蒸汽灭菌6min，100 mbar真空干燥10min。

②将金黄色葡萄球接种于6 ml葡萄糖营养肉汤培养基内，取37℃培养16h后的菌悬液作活菌计数。

③将预处理的样片外表面朝上平铺于无菌平皿内。

④用含107cfu/ml的金黄色葡萄球菌悬液滴到样片上，互不接触滴5滴，每滴0.1 ml。

⑤将染菌样片在温度20℃～25℃，相对湿度40%～50% 条件下放置使其干燥，时间不超过6h。

⑥将染菌样片平铺于血琼脂培养基表面，完全接触，染菌面朝上，5s～6s后将样片移开。

⑦将血琼脂培养基于37℃培养16h～24h进行菌落计数。

3) 结果报告：每个血琼脂培养基平板上生长的菌落数以及5个平板上生长的菌落总数。

4) 评价

①5个培养基平板上均无菌生长，试验菌不能透过样片。

②如5个培养基平板上生长的菌落总数≤5，则用20个样片复测，在20个平板上生长的菌落数≤5为合格。

(2) 干性条件下微生物屏障性能

1) 器材

①试验瓶：250 ml有盖玻璃瓶，螺旋盖带有34 mm的孔：密封垫圈内径34 mm，由聚四氟乙烯(PTFE)或带PTFE覆盖层材料制成。

②试验微生物：枯草杆菌黑色变种 (ATCC 9372) 芽孢

③培养基：营养琼脂培养基

④铝泊、滤纸

2) 操作步骤

①取100ml含106cfu/ml芽孢的乙醇(96%) 悬液与100g无菌石英粉 (0.04mm～0.15mm)混合，50℃干燥16h。

②在试验瓶内加入20ml营养琼脂培养基并使凝固。

③将10个直径为42mm的圆形样片分别置于试验瓶两个密封垫圈之间，并用螺旋盖适当压紧，使样片被密封垫圈紧压在瓶沿上。

④将试验瓶用铝泊包裹，于121℃灭菌20min。

⑤灭菌并冷却后，移去铝泊包裹，称取0.25g染菌石英粉均匀撒于样片上。

⑥将试验瓶放入培养箱加热到50℃，取出放入冷藏箱降至10℃。如此为1次，重复5次。

⑦将试验瓶置37℃培养24h，数菌。

3) 结果报告: 每个样片透过的菌落数及10个样片透过的菌落总数。

4) 评价：每个样片透过的菌落数应≤5cfu，10个样片透过的菌落总数应≤15cfu。

2.1.7.6 毒性鉴定

2.1.7.6.1检验要求

接触医疗用品与病人的包装材料，在灭菌前、后均应无皮肤刺激、眼刺激与致敏作用以及无细胞毒性。

2.1.7.6.2检测方法

按本规范2.3消毒剂毒理学检验技术中相应的方法测试。

2.1.7.7 无菌有效期鉴定

2.1.7.7.1样品放置条件

(1)自然留样法

将样片放置室温下，模拟室内货架贮存，每周记录湿度与温度，按产品使用说明书规定的有效期取样检测。

(2)加速老化法

把样片置于温度为60℃～65℃、相对湿度为80%±5%的干燥器内7d后抽样进行检测，相当于室温下放置180d。

2.1.7.7.2鉴定项目

(1)微生物屏障性能：按2.1.7.5 微生物屏障性能鉴定方法测试。

(2)无菌性保持：按中华人民共和国药典( 2000年版二部 附录 Ⅺ H )“无菌检查法” 测试。

2.1.8  抗（抑）菌试验

2.1.8.1  目的

测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。

常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞 留 抑 菌 效 果 测 定 试 验 、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验，可视情况选用。

2.1.8.2  抑菌环试验

2.1.8.2.1  原理

利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。  

2.1.8.2.2 试验器材

(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液(见 2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。

(2)抑菌剂载体 (5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃ 烤干2h，保存备用)。

(3)活菌培养计数所需器材(见2.1.1.3)。

(4)微量移液器(5μl～50μl，可调式)。

(5)游标卡尺。

(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基

2.1.8.2.3  操作程序

(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液 20μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃) 中烤干，或置室温下自然干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为 5mm，厚不超过 4mm圆片(块)，每 4 片(块) 一组。

(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水 20μl，干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片(块)。

(3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×105cfu/ml～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动 60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥 5min。

(4)抑菌剂样片贴放:每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1 片阴性对照样片，共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25mm以上，与平板的周缘相距 15mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱，培养16h～18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。试验重复3次。

测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。 测量其直径应以抑菌环外沿为界。

2.1.8.2.4  评价规定

(1)抑菌作用的判断:

抑菌环直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。

抑菌环直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。

(2) 3 次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。

(3)阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。

2.1.8.2.5  注意事项

(1)每次试验均应设置阴性对照，不可省略。在报告中亦必须将对照组的结果列出。

(2)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大; 浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。

(3)应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。

(4)培养时间不得超过 18h。培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。

(5)抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。

2.1.8.3 最小抑菌浓度测定试验（琼脂稀释法）

2.1.8.3.1原理

本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。本方法适用于不溶性抗（抑）菌产品。  

2.1.8.3.2 试验器材

（1）菌株

金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099或ATCC 11229。

可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。

（2）水解酪蛋白琼脂培养基（MH），称取38gMH琼脂培养基，溶于1000ml水中，加热至沸腾溶解，然后121℃高压灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用，此培养基将用于对照试验。

（3）0.03mol/L磷酸盐缓冲液pH7.2。

（4）加样器（1μl～10μl）。

（5）45℃～50℃水浴恒温箱。

（6）吸管、试管、平皿。

（7）37℃培养箱。

2.1.8.3.3 操作步骤

（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取5ml或5g（固体研磨后）样品，放入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，配成10%的均匀分散的溶液或悬液。

（2）含抗菌剂培养基配制：将已配成10%的抗（抑）菌溶液或悬液用PBS做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，置45℃～50℃水浴恒温备用。

（3）双倍浓度培养基配制：称取76gMH琼脂培养基，溶于1000ml水中。加热至沸腾溶解。然后121℃压力蒸汽灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用。此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。

（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取10ml系列稀释的抗菌液加入平皿内。将在45℃～50℃水浴中的双倍MH琼脂培养基10ml，加入平皿内 ，边加边摇晃平板，使抗（抑）菌液和培养基充分混匀，待凝固后备用。

（5）用加样器取1μl～2μl（含菌量约为107cfu/ml）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约5mm～8mm（每个点菌量约为104cfu）。

（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。

（7）将接种后的平板放置35℃培养箱中，倒置培养18h～24h，观察结果。

2.1.8.3.4 评判规定

菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。

2.1.8.3.5 注意事项

（1）接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种，最后接种对照平板。

（2）为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过4个。

2.1.8.4 最小抑菌浓度测定试验（营养肉汤稀释法）

2.1.8.4.1原理

本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。本方法式用于可溶性抑菌产品。  

2.1.8.4.2 试验器材

（1）试验菌株：金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099或ATCC 11229。

可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。

（2）营养肉汤培养基，见附录A。

（3）稀释液，见附录A。

（4）吸管、试管 

（5）37℃培养箱。

2.1.8.4.3 操作步骤

（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液 

（2）含抗菌剂培养基配制：将抗（抑）菌溶液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，取各稀释度受试液2.5ml加入到含2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中。

（3）取0.1ml含菌量约为108cfu/ml菌悬液接种于含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为试验组样本。

（4）以同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组样本。

（5）取2支含营养肉汤的试管中，作为阴性对照组样本。

（6）将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置37℃培养箱中，培养48h，观察结果。

（7）试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。

2.1.8.4.4 评判规定

当阳性对照管有细菌生长(混浊)，阴性对照管无菌生长(透明)，试验用菌悬液的作用浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml时，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗（抑）菌剂浓度，为该样品对受试菌的MIC。

2.1.8.4.5 注意事项

接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度依次接种，

2.1.8.5 滞 留 抑 菌 效果 试 验

2.1.8.5.1 原 理

本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下，使用随机性、双盲的、配对比较的方法检测抗（抑）菌香皂和抗菌沐浴露12h或24h的滞留抑菌效果。

2.1.8.5.2试验器材

(1) 试验产品: 试验品为25套按顺序编号的香皂样品。每套2块，一块为测试样品皂，另一块为不含抑菌剂的对照皂。

(2) 不含抑菌剂的洗发水 25瓶（200ml/瓶）

(3) 不含抑菌剂的香皂 25块

(4) 胰蛋白酶大豆肉汤培养基(TSB)

(5) 胰蛋白酶大豆琼脂培养基（TSA）

(6) 0.075mol/L的磷酸盐缓冲液

(7) 70%酒精

(8) 恒温箱

(9) 金属筒 （直径55.00000000000001px、高度75px）

(10) 一次性接种环（直径4mm）

(11) 小塑料碗（直径55.00000000000001px，高2.5mm，）

(12) 胶带（Darapore，3M公司生产）

(13) 尼龙刮菌棒

(14) Triton-X 100  500ml

(15) 外用抗生素软膏(例如:百多邦莫匹罗星软膏)

(16) 玻璃弯棒

(17) 羊血

(18) 金黄色葡萄球菌ATCC 27217（此株金黄色葡萄球菌是一种低毒性、对青霉素敏感、对四环素有抗药性的色素株，曾用于许多试验研究，没有任何严重副作用）。

(19) 皮肤消毒剂

2.1.8.5.3 试验步骤

(1)调整阶段

试验开始前7d至14d，受试者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗发水和沐浴液进行日常的洗手、洗澡。此阶段持续至少7d，但不超过14d。

(2)清洗阶段

清洗阶段共3d，受试者每天用抑菌皂清洗一侧前臂，用对照皂清洗另一侧前臂，清洗过程如下:

1）先清洗左臂，用流动水（水温应保持在35℃～37℃）打湿前臂内侧；

2）用香皂从手腕至臂肘上下摩擦15s；

3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；

4）用流动的清水冲洗前臂15s，不要搓擦；

5）用纸巾沾干前臂. 不要搓擦；

6）重复以上步骤清洗右臂；

7）按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂3次，每次间隔至少一个小时，在最后一次清洗之后，需记录好时间，在12h之后，进行滞留效果检测。在第9次清洗前臂以后，受试者不能洗澡、淋浴或洗净前臂，直到试验结束。用品包的标签上注明洗哪只手臂。清洗前后的两块香皂的重量及受试者完成清洗的情况，须记录下来。

（3）试验阶段

清洗阶段的第四天(最后一次清洗后 12h或24h)，将在受试者每只前臂上划出一个试验区，对试验区进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤如下:

1）将金黄色葡萄球菌（ATCC 27217）连续转种3代，取第3代培养物接种于胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）中，在35℃±2℃的条件下培养20h ±2h。然后用胰蛋白酶大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为108cfu/ml～109cfu/ml。

2）细菌接种: 在受试者的每只前臂中间部位（不要在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为75px的玻璃量筒扣在皮肤上，划分出一个试验区。使用加样器取10μl上述菌悬液，接种于前臂试验区（菌落数为106cfu/试验区～107cfu/试验区），用一次性接种环，把接种物涂成一圆形，使其与试验区边缘应有4mm～5mm的距离。

3）封包:细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面 ，再用胶带将小塑料碗固定在皮肤上，记录封包的时间。

4）回收存活细菌：接种后2h±5min 对前臂上接种的区域进行取样。将金属筒放置于试验区中间部位，不要接触到盖有印墨的边缘。将1ml含0.1% triton-X100的0.075mol/L磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤60s，将筒内液体吸移至试管内，再加1ml含0.1%triton X-100的0.075mol/L磷酸盐缓冲液，对该区域内的皮肤进行第2次刮洗30s，将第2次擦洗的液体，注入含第1次刮洗液体的试管中。

5）实验区试验后的消毒处理: 一个实验区采样之后，需用70%的酒精对实验区进行消毒。然后对另一个实验区以同样方法进行采样，采样结束后，先用70%的酒精对实验区进行消毒，然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏。

6）平皿接种与培养:对每一个取样进行平皿接种，以0.0375mol/L磷酸盐缓冲液对样品进行10倍系列稀释，选适当稀释度取0.1ml接种于2个含5%羊血的TSA平板表面，用玻璃弯棒涂匀，在35℃±2℃的培养箱中培养48h ±4h，计数菌落数。

7）抑菌率的计算

抑菌率=[ （对照平均菌落数－试验平均菌落数）/ 对照平均菌落数] ×100%

2.1.8.5.4  判定标准

试验不得少于16人次，抑菌率≥50%，可判定该产品在规定的时间内有滞留抑菌作用。

2.1.8.5.5注意事项

（1）受试者录用标准

①年龄介于18岁至65岁的男性或女性；

②受试者应身体健康；

③前臂应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题；

④同意在整个试验期间，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部类固醇类药和全身或局部使用抗生素，除非因为并发病症医生要求使用；

⑤同意在清洗阶段使用非药物香皂或洗液洗澡和淋浴，但受试者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗净前臂，直到试验结束。

（2）排除受试者的标准  如果受试者有下列情况之一，不能被录用参加试验

① 同时参加另外一个临床试验

② 在过去的14d中，参加过任何一种形式的关于清洁手或手臂的试验

③ 对香皂、去污剂、香水或青霉素过敏

④ 怀孕妇女

⑤ 诊断患有糖尿病、肝炎、艾滋病（HIV阳性）、器官移植者，

（3）其它试验限制

① 受试者不得使用其它清洁用品；

② 受试者应避免洗热水盆浴和游泳；

③ 受试者应避免接触未干的油漆、涂料或者其它溶剂；

④ 受试者应避免在手腕处和前臂上喷洒香水。

（4）在试验完成后的48h～72h内，需检查前臂上有无小脓疱、水疱，隆起的红色痒疱。出现这些情况的受试者应尽快通知检验单位。

2.1.8.6洗衣粉抗（抑）菌效果鉴定方法8

2.1.8.6.1 原 理

本 方 法 通过 模 拟 洗 衣 机 的 洗 衣 过 程 ，检 测 抗 （抑）菌 洗 衣 粉（剂）的 抗 菌 作 用 。

2.1.8.6.2  试 验 器 材

（1） 试 验 菌 株

大 肠 杆 菌 A T C C 1 1 2 2 9，金 黄 色 葡 萄 球 菌  A T C C 6 5 3 8。

（2）培 养  基

营 养 琼 脂（ 琼 脂 含 量 为1.5%）

营养琼脂A：在营养琼脂中另加入1.5 %的琼脂。

TSA营养肉汤。

（3）牛 血 清 白 蛋 白（ 过 滤 除 菌）

（4）烷 基 酚 聚 氧 乙 烯 醚 （Tergitol ）

（5）碳 酸 钠                 

（6）标准   硬 水

（7）非 离 子 浸 湿 剂 ：  见 测 试 棉布 制 备 部 分

（8）冲 洗 溶 液  

（9） 中 和 剂（ 经 中 和 剂 鉴 定 试 验 合 格 ）

（10） 吐 温80  ( 过 滤 除 菌 )

（11）去 离 子 水 或 蒸 馏 水灭 菌

(12)不锈钢转轴（由 一 条 直 径4px 不 锈 钢 丝 制 成，如 图2-2）

俯 视 图               侧 面 图

图2-2    缠 绕 测 试 布 条 的 不 锈 钢 转 轴

（13）有 金 属 螺 盖 的 玻 璃 罐（ 容 积 为470 ml ，可 高 压 灭 菌 ， 并 可 放 入 转 轴 的 广 口 罐），将 罐 口 覆 盖 牛 皮 纸 ，加 盖 ，于121C灭 菌2 5 min  备 用。

（14）转 动 速  度 为45 r/ min～6 0 r/ min 的 滚  动 摇 床

（15）可 调 恒 温 水 浴 箱

（16）吸 管 ( 1ml， 5ml，和 10 ml)

（17）培 养 皿

（18）铺 有 滤 纸  的 玻 璃 培 养 皿。

（29）菌 种 保 存 管

（20）细 菌 培 养 箱

（21）涡 流 振 荡 器

（22）细 菌 比 浊 仪

（23）棉布（32支纱/cm×32支纱/cm平织棉布）

（24）别 针、镊 子、无 菌 手 套 、3mm～5 mm玻 璃 珠 、秒 表、载 体 布片62.5px×93.75px ，见 测 试 棉布 准 备。

2.1.9一次性使用医疗用品产品细菌和真菌污染的检测

2.1.9.1  细菌或真菌污染总菌数的检测

2.1.9.1.1  目的

检测一次性使用医疗用品消毒后残存细菌或真菌状况，存放一定时间后是否被细菌或真菌污染及其污染的程。

2.1.9.1.2  适用范围

临床用于病人检查、治疗、护理用指套、手套、吸痰管、阴道窥镜、肛镜、印模托盘、治疗巾、皮肤清洁巾、擦手巾、压舌板、臀垫、中单等接触完整粘膜、皮肤的各类一次性使用医疗、护理用品。

2.1.9.1.3  试验器材

（1）营养琼脂培养基：见附录A。

（2）沙堡琼脂培养基（真菌培养用）：见附录A。

（3）无菌检查用洗脱液：见附录A。

（4）磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）：见附录A。

（5）100级洁净室或100级层流超净工作台（下简称超净台）。

（6）安全操作箱（用于防止真菌孢子污染周围环境）

（7）刻度吸管（1.0mol、5.0mol）

2.1.9.1.4  抽样要求

（1）抽样方法

为使样品具有良好的代表性，采用随机抽样方法。随机选取不同3个批号的产品。根据检验要求，从每个批号产品中随机抽取同等数量的样品，尽量选自多个大包装。不得在同一批号内的同一包装内邻近部位集中选取所需全部样品。

（2）抽样数量

①对单一品牌、型别（或规格）产品鉴定取样：随机选取不同3个批号的产品。从每个批号产品中随机抽取3个大包装。从每个大包装中随机抽取20个最小销售包装产品（每个最小销售包装产品重量应达到10g以上；棉签等每个包装内数量达到5支以上，以满足检验最低需要量。如果重量低于10g或数量少于5支时，适当增加抽取产品的最小销售包装数量。）作为该品牌、批号产品抽检样品。其中1/4样品用于首次检测，1/4样品用于留样，2/4样品用于必要时的复测。样品最小销售包装应完整无破损（包装破损即可视为不合格产品、禁止出售），检测前不得开启。

②对同一品牌、不同型别（或规格）产品鉴定取样：分别对不同型别（或规格）产品进行随机抽检。对每个型别（或规格）产品随机选取不同3个批号产品。从每个批号产品中随机抽取3个大包装。以下步骤同2.1.9.1.4（2）①。

③对不同一品牌、不同一型别（或规格）产品鉴定取样：分别对不同品牌、型别（或规格）产品进行随机抽检。对每个品牌的每一个型别（或规格）产品随机选取不同3个批号的产品。从每个批号产品中随机抽取3个大包装。以下步骤同2.1.9.1.4（2）①。

2.1.9.1.5  检测样本的制作

（1）检测数量

①每批样品首次检测时，检测5个样本，分别在所选的5个最小销售包装内抽取。

②必要时进行复测。复测时，检测10个样本，分别在所选的10个最小销售包装内抽取。

③以下的样本制作均按首次检测设计，复测时样本量加倍。

（2）样本制作

①垫单、手套等产品的样本制作：分别在所选5个最小销售包装内样品的不同部位剪取10g重样片。共5份。分别剪碎后，各放入一含100ml洗脱液试管中，震荡20s或振打80次。待样本碎片沉淀后，取各管洗液分别进行检测。

②指套等小件物品的样本制作：在所选5个最小销售包装内样品中各选一个样本，共5份。分别剪碎后，各投入含10ml洗脱液试管中，每管一个样本。震荡20s或振打80次，取各管洗液分别进行检测。

③棉签.在所选5个最小销售包装内样品中，各选5支为一个样本，共5份。分别直接投入含10ml洗脱液试管中，每管一个样本。震荡20s或振打8 0次，取各管洗脱液分别进行检测。

④对不能用上述方法采样的物品，在所选5个小包装中各选一个样本。共5份。分别用无菌棉拭子涂抹法采样。每样本涂抹采样面积625px²。采样后，按无菌操作原则剪下棉拭采样端置于10ml采样液试管中，每管一份样本。震荡20s或振打8 0次，取各管采样液分别进行检测。

2.1.9.1.6  细菌检测操作程序

（1）样本制备后，应立即进行检测。

（2）每一样本洗脱液或采样液接种2个平皿，每个平皿接种1.0ml。当估计含菌量过高时（每平板生长菌落数超过300个），应用PBS对洗脱液或采样液作适当稀释后再接种。为取得适宜的菌落数，应接种2个～3个不同稀释度样液。每吸取一个稀释度样液，换一支无菌吸管。

（3）将45℃左右融化的营养琼脂培养基倾注于已加入样液的平皿中。每平皿约15 ml～20ml。盖好、与样液混均、平放。待培养基凝固后，翻转平板使底向上，置37℃恒温培养箱内培养48h后，计数菌落数。

（4）菌落数计算：接种洗脱液或采样液原液进行培养者，即使生长的菌落数<15cfu/平板时，仍按实际生长菌落数计算；接种不同稀释度洗脱液或采样液进行培养时、应选择生长的菌落数在15cfu/平板～300cfu/平板之间的稀释度进行菌落数计算。

（5）检测时应设阴性、阳性对照组。阴性对照组：①用同批营养琼脂培养基倾注平板直接培养；②分别吸取1.0ml同批洗脱液与PBS各2份，分别接种平皿、倾注营养琼脂培养基进行培养。阳性对照组：接种金黄色葡萄球菌（ATCC6538）18h新鲜肉汤培养物1.0ml于平皿内，倾注营养琼脂培养基进行培养。培养条件为37℃恒温培养培养48h后观察结果。若阴性对照组有菌生长，说明其中培养基、洗脱液、PBS灭菌不合格或被污染；若阳性对照组无菌生长或生长的菌落不正常，说明其中使用的培养基、培养条件可能存在问题或均存在问题。以上两种情况均需更换培养基重新进行试验。

2.1.9.1.7  真菌检测操作程序

（1）真菌的检测操作程序与细菌检测操作程序基本相同，主要区别在于所用培养基、培养温度、培养时间不同。真菌培养使用沙堡琼脂培养基。倾注法接种。20℃～25℃恒温培养72h，计数菌落数。为防止真菌孢子飞扬污染环境，真菌菌落计数应在安全操作箱内进行。

（2）检测时设阴性、阳性对照组。方法与2.1.9.1.6（5）相同。阳性对照组接种白色念珠菌（ATCC10231）。20℃～25℃恒温培养72h观察结果。

2.1.9.1.8  结果计算

将2个平板计数所得菌落数的平均值乘以稀释倍数即得洗脱液或采样液中每毫升所含菌量（cfu/mL）。根据每毫升所含菌量推算出每个样本的菌量。其表达单位可根据情况使用cfu/cm²、cfu/g、cfu/样本。

2.1.9.1.9  注意事项

（1）严格无菌操作防止污染。

（2）同批样品检验洗脱振敲次数要保持一致。振敲轻重尽量保持一致。

（3）吸量管取液量应准确，减少使用中误差。

（4）样液接种后应尽快倾注培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。

（5）计算结果时，注意核对接种样液稀释倍数，以免发生计算错误。

2.1.9.2  无菌检验试验

2.1.9.2.1  目的

检测医疗用品经灭菌处理后是否达到无菌标准。

2.1.9.2.2  试验器材

（1）需氧-厌氧菌培养基：见附录A。

（2）无菌试验用真菌培养基（下简称真菌培养基）：见附录A。

（3）无菌检验用洗脱液（下简称洗脱液）：见附录A。

（4）100级洁净室或100级层流超净工作台（下分别简称洁净室与超净台）

2.1.9.2.3  抽样要求

（1）抽样方法：为使样品具有良好的代表性，采用随机抽样方法。随机选取不同3个批号的产品。根据检验要求，从每个批号产品中随机抽取同等数量的样品，尽量选自多个大包装。不得在同一批号内的同一包装内邻近部位集中选取所需全部样品。

（2）抽样数量

1）对单一品牌、型别（或规格）产品鉴定取样：随机选取不同3个批号的产品。从每个批号产品中随机抽取3个大包装。敷料、手术衣等织物或纸制产品，从每个大包装中随机抽取8个最小销售包装产品作为该品牌、批号产品抽检样品；针灸针、注射器、输液器等器具，从每个大包装中随机抽取28个最小销售包装产品作为该品牌、批号产品抽检样品。其中1/4样品用于首次检测，1/4样品用于留样，2/4样品用于必要时的复测。样品最小销售包装应完整无破损（包装破损即可视为不合格产品、禁止出售），检测前不得开启。

2）对同一品牌、不同型别（或规格）产品鉴定取样：分别对不同型别（或规格）产品进行随机抽检。对每个型别（或规格）产品随机选取不同3个批号产品。以下步骤同2.1.9.2.3（2）1）。

3）对不同一品牌、不同一型别（或规格）产品鉴定取样：分别对不同品牌、型别（或规格）产品进行随机抽检。对每个品牌的每一个型别（或规格）产品随机选取不同3个批号的产品。以下步骤同2.1.9.2.3（2）1）。

2.1.9.2.4 采样前准备

（1）采用平板尘降法检测洁净室或超净台内空气的含菌量：用φ225px双平板暴露30min对空气采样后进行培养。平均菌落数≤1.0cfu/平板为合格。

（2）需氧-厌氧培养基培养性能检查：接种1.0ml含10个以下的藤黄微球菌[Micrococcus lutea，CMCC（B）28001]菌悬液，置30℃～35℃培养24h后，应生长良好。另接种1.0ml含50个以下的生孢梭菌[Clostridium  sporogenes，CMCC（B）64941] 菌悬液，置同样条件，亦应生长良好。

（3）真菌培养基培养性能检验：接种1.0ml含50cfu以下的白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F）98001]菌悬液，置20℃～25℃培养24h后应生长良好。

（4）洗脱液无菌检查：于无菌检查前3d，向需氧-厌氧菌培养基与真菌培养基内各接种1.0ml洗脱液，分别置30℃～35℃与20℃～25℃条件下，培养72h后应无菌生长。

（5）培养基无菌检查：于无菌检查前3d，将未种菌的需氧-厌氧菌培养基与真菌培养基分别置30℃～35℃与20℃～25℃条件下，培养72h后应无菌生长。

（6）阳性对照菌悬液制备：于无菌试验前一天，取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]普通琼脂斜面新鲜培养物1接种环，接种于需氧-厌氧菌培养基内，在30℃～35℃培养16h～18h备用。用时以无菌生理盐水稀释至1：10⁶ 。

（7）无菌室与试验台消毒：对无菌室地面与桌面以及试验台台面擦净消毒后，将无菌试验用的培养基、洗脱液、供试品及其他需用器材放妥。开启紫外线灯消毒1h。

2.1.9.2.5操作程序

（1）工作人员穿戴无菌隔离衣、帽、口罩、鞋后进入无菌室，用70%乙醇棉球消毒双手。

（2）将供试品外包装用70%乙醇擦拭消毒后放于试验台上。

（3）取需氧-厌氧培养管与真菌培养管各1支，打开盖（或塞）置试验台上，直至样本无菌检查试验完毕。盖上盖（或塞）与供试品一起培养，作为阴性对照。

（4）按无菌操作要求打开供试品外包装，按以下规定方法制备样本接种需氧-厌氧培养管与真菌培养管。

2.1.9.2.6  检测样本的制作

（1）检测数量

1）每批样品首次检测时，检测1/4样本，分别在所选的最小销售包装内抽取。

2）必要时进行复测。复测时，检测2/4样本，分别在所选的最小销售包装内抽取。

3）以下的样本制作均按首次检测设计，复测时样本量加倍。

（2）样本制作

1）敷料、手术衣等非管道类样本。取2个包装内的样本，于不同部位剪取约25px×75px大小的样片21片，接种需氧-厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管。每培养管含培养基40ml，各接种3片样片。在其中一加有样本的需氧-厌氧培养管中接种1.0ml金黄色葡萄球菌稀释悬液[见2.1.9.2.4（6）]作为阳性对照。

2）注射针、针灸针、缝合针、棉签等样本。在所选7个最小销售包装内样品中，各选1支为一个样本，分别接种于需氧-厌氧培养管5管与真菌培养管2管，每管含培养基15.0ml，在其中一支加有样本的需氧-厌氧菌培养管中接种1.0ml金黄色葡萄球菌稀释悬液[见2.1.9.2.4（6）]作为阳性对照。

3）输液（血）器等导管类样本。在所选7个最小销售包装内样品中，各选1支为1个样本，各以无菌注射器吸取5.0ml～10.0ml无菌洗脱液注入管内往返摇荡5次。将各样本洗脱液分别接种需氧-厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管。培养管含培养基15.0ml，每管接种样本洗脱液1.0ml。在其中1支加有样本洗脱液的需氧-厌氧菌培养管中接种1.0ml金黄色葡萄球菌稀释悬液[见2.1.9.2.4（6）]作为阳性对照。

4）注射器样品。在所选7个最小销售包装内样品中，各选1支为1个样本，各吸取经灭菌合格的洗脱液2ml～10ml，将芯杆抽取至全程刻度，振摇5次。将各管洗脱液分别接种需氧-厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管。洗脱液接种量，对1ml注射器为0.5ml；2ml注射器为1.0ml；5ml～10ml 注射器为2.0ml；20 ml～50ml注射器为5.0ml。培养管中的培养基量，对洗脱液接种量在2ml以下者，每管为15.0ml；接种量在5ml者，每管为40.0ml。在其中1支加有样本洗脱液的需氧-厌氧菌培养管中接种1.0ml金黄色葡萄球菌稀释悬液[见2.1.9.2.4（6）]作为阳性对照，

5）其他样本。不能用上述方法处理的，可用无菌棉拭子涂抹法采样。每个样本涂采面积不得少于625px²。采样后将棉签直接剪入培养管中。每次检测7个样本，分别接种需氧-厌氧菌培养管5管与真菌培养管2管，每支培养管含培养基15.0ml。在其中1支加有采样棉拭子的需氧-厌氧菌培养管中接种1.0ml金黄色葡萄球菌稀释悬液[见2.1.9.2.4（6）]作为阳性对照。

6）将上述接种样本或接种样本洗脱液、采样棉拭子后的需氧-厌氧菌培养管、阳性对照管与阴性对照管[见2.1.9.2.5（3）]同时放入30℃～35℃恒温培养箱内、连续培养5d，逐日观察培养结果。

将上述接种样本或接种样本洗脱液、采样棉拭子后的真菌培养管、阳性对照管与阴性对照管[见2.1.9.2.5（3）]同时放入20℃～25℃恒温培养箱内、连续培养7d，逐日观察培养结果。

阳性对照管应有菌生长，阴性对照应无菌生长，否则试验重做。

2.1.9.2.7  结果评价

当阳性和阴性对照管培养的结果符合2.1.9.2.6（6）所示要求，接种有样本或样本洗脱液、采样棉拭子的需氧-厌氧菌培养管及真菌培养管（不包括阳性对照管）均呈澄清（或虽浑浊但经证明并非有菌生长者），应判供试品合格。

如接种样本或样本洗脱液、采样棉拭子（不包括阳性对照管）的需氧-厌氧菌培养管及真菌培养管中有任何一管呈浑浊，并确认有菌生长时，应用同批样本进行复测。复测中，除阳性对照管外，其他各管均无菌生长，仍可判为合格，否则应判供试品不合格。

2.1.9.2.8  注意事项

（1）严格无菌操作，防止污染。

（2）试验前各项准备工作和试验中的阳性和阴性对照，均不可省略，否则难以下结论。

2.1.9.3 卫生监督抽样

2.1.9.3.1  细菌或真菌污染总菌数的检测抽样要求

(1) 抽样方法

采用随机抽样方法。随机选取同一个批号的产品。

(2) 抽样数量

1）对单一品牌、型别（或规格）产品取样：从同一批号的产品中随机抽取3个大包装。从每个大包装中随机抽取5个最小销售包装产品（每个最小销售包装产品重量应达到10g以上；棉签等每个包装内数量达到5支以上，以满足检验最低需要量。如果重量低于10g或数量少于5支时，适当增加抽取产品的最小销售包装数量。）作为该品牌、批号产品抽检样品。其中1/3样品用于首次检测，2/3样品用于必要时的复测留样。样品最小销售包装应完整无破损（包装破损即可视为不合格产品、禁止出售），检测前不得开启。

2）对同一品牌、不同型别（或规格）产品取样：分别对不同型别（或规格）产品进行随机抽检。对每个型别（或规格）产品随机选取同一个批号产品。从同一批号的产品中随机抽取3个大包装。以下步骤同2.1.9.3.1（2）1)。

3）对不同一品牌、不同一型别（或规格）产品鉴定取样：分别对不同品牌、型别（或规格）产品进行随机抽检。对每个品牌的每一个型别（或规格）产品随机选取同一个批号产品。从同一批号的产品中随机抽取3个大包装。以下步骤同2.1.9.3.1(2) 1)。

(3)样品处理及检验操作程序等步骤同2.1.9.1.5～2.1.9.1.9。

2.1.9.3.2 无菌检验试验抽样要求

（1）抽样方法

采用随机抽样方法。随机选取同一个批号的产品。

（2）抽样数量

1）对单一品牌、型别（或规格）产品取样：从同一批号的产品中随机抽取3个大包装。敷料、手术衣等织物或纸制产品，从每个大包装中随机抽取2个最小销售包装产品作为该品牌、批号产品抽检样品；针灸针、注射器、输液器等器具，从每个大包装中随机抽取7个最小销售包装产品作为该品牌、批号产品抽检样品。其中1/3样品用于首次检测，2/3样品用于必要时的复测留样。样品最小销售包装应完整无破损（包装破损即可视为不合格产品、禁止出售），检测前不得开启。

2）对同一品牌、不同型别（或规格）产品取样：分别对不同型别（或规格）产品进行随机抽检。对每个型别（或规格）产品随机选取同一个批号产品。从同一批号的产品中随机抽取3个大包装。以下步骤同2.1.9.3.2(2)1)。

3)对不同一品牌、不同一型别（或规格）产品鉴定取样：分别对不同品牌、型别（或规格）产品进行随机抽检。对每个品牌的每一个型别（或规格）产品随机选取同一个批号产品。从同一批号的产品中随机抽取3个大包装。以下步骤同2.1.9.3.2.(2)1)。

2.1.10  隐形眼镜护理液鉴定试验   略

2.1.11一次性使用卫生用品鉴定试验   略

2.2 消毒产品理化检验技术规范

2.2.1 消毒产品原料或单方制剂的测定法   

2.2.1.1  常用器材 

(1) 移液管 (1 ml、5 ml、10 ml、25 ml)；移液器（100μl，1000μl）。

(2) 滴定管 (2 ml、5 ml、10 ml、15 ml、25 ml、50 ml，酸式与碱式)。

(3) 毛细滴管。

(4) 碘量瓶 (100 ml、250 ml)。

(5) 容量瓶 (50 ml、100 ml、250 ml、1000 ml)。

(6) 锥形瓶 (100 ml、250 ml、500 ml)。

(7) 称量杯 (瓶)。

(8) 吸球。

(9) 分液漏斗（250 ml）。

(10) 研钵。

(11) 量筒。

(12) 烧杯。

(13) 垂熔玻璃滤器。

(14) 酒精比重计。

(15) 天平 (感量 0.1 mg)。

(16) 比色皿。

(17) 分光光度计。

(18) 大气采样器。

(19) 注射器(1ml、5ml、100ml)；微量注射器(10μl、25μl、100μl)。

(20) 气相色谱仪。

(21) 高效液相色谱仪。

2.2.2 复方消毒产品有效成分含量测定的指导原则

2.2.2.1 分析方法的选择

首选仪器分析法，如色谱分析法、光学分析法以及电化学分析法等；化学分析法经证实可靠者，也可以采用。

2.2.2.2 分析方法的可靠性论证

(1)专属性  经试验验证，除有效成分以外的其它成分均不得干扰有效成分的测定。

(2)准确性  以加标回收百分率表示。回收百分率一般在平均值X±10.0%之间(n≥6)。

(3)重复性  某已知含量的模拟样品，用该法连续测定六次，其RSD应≤5.0%(n≥6)。

(4) 回归方程的线性    配制一系列已知浓度的模拟样品五份（高、低浓度之间的倍数一般为5倍～10倍），用某法测定。以测定信号(如色谱峰面积或峰高、吸光度等)对其浓度(或质量)进行线性回归，其相关系数应满足 r ≥0.999(n≥5)。

(5) 灵敏度    即用某法测定某样品的最低检出浓度（S/N=3）。

2.2.3 消毒产品稳定性测定 

2.2.3.1 外观检查

除测定有效成分含量或杀灭微生物效果外，还应观察记录消毒剂有无颜色变化；并且对液体消毒剂应观察记录有无沉淀或悬浮物产生，对片剂应观察记录外观性状是否完好。性状变化的记录应写进检测报告。

2.2.3.2  化学测定法：

2.2.3.2.1  加速试验法：

(1)取包装好的消毒剂，置37℃(对粉剂、片剂要求相对湿度>75%)恒温箱内3个月，或 54℃恒温箱内14d。于放置前、后分别测定消毒剂杀菌有效成分含量。每次检测样品为三批，每批样品重复测2次，取其平均值即可。

(2) 加速试验法结果评价以有效成分下降率超过10%为不符合要求。 若经37℃存放3个月的样本，其杀菌有效成分含量下降率≤10%，可将贮存有效期定为2年；经54℃存放14d者，杀菌有效成分下降率≤10%，则贮存有效期可定为1年。

(3) 未通过本试验的消毒剂，或欲观察2年以上储存有效期的消毒剂，可按下述室温留样法（2.2.3.2.2）测定其储存有效期。

(4) 测定结果应对其性状变化进行描述，若因有颜色等性状变化而无法进行有效成分经验法测定时，以室温留样法结果为准。

2.2.3.2.2  室温留样法：

取已测有效成分含量并包装好的消毒剂，放置温度为25℃±2℃环境 (记录温度)，按产品保存期时限（企业提供），取样测定有效成分含量，有效成分含量下降率≤10%为通过。

2.2.3.3  微生物测定法

    (1) 贮存方法和取样要求同化学测定法(2.2.3.2)。

    (2) 在杀灭或抑制微生物试验中，所用试验微生物应为使用说明书中拟杀灭或抑制微生物中抗力最强者。

    (3) 对只使用原液消毒的消毒剂，直接用其原液进行杀菌或抑菌试验。对需稀释后使用的消毒剂，则以其使用说明书中杀菌合格最低浓度的溶液进行试验。

    (4) 该实验作用时间、分组及其他试验条件均应与原杀灭试验相同。

(5) 贮存后样品增加10%的浓度，对微生物的杀灭效果仍能达到消毒的要求，可判为通过，比照2.2.3.2.1和2.2.3.2.2定出贮存有效期。

2.2.4  消毒剂对金属腐蚀性的测定

2.2.4..1  目  的

测定消毒剂对各种金属的腐蚀程度，以能注明在使用时是否需给予应有的注意。

2.2.4.2  常用器材

    (1) 金属片 

    圆形，直径24.0 mm，厚1.0 mm，穿一直径为2.0mm 小孔，表面积总值约为9.80 cm² (包括上、下、周边表面与小孔侧面)。光洁度为6。原料如下:

        碳钢 (规格见 GB 700-65)；    铜     (规格见 GB 2060-80)；

        铝   (规格见 GB 1173-74)；   不锈钢 (规格见 GB 1220-75)。

    碳钢易氧化生锈，应保存于油中。 

(2) 浸泡容器(玻璃制，带盖，容积为800 ml～1000 ml)。

(3) 砂纸(120号粒度水砂纸，GB 2477)。

(4) 称量杯。

    (5) 天平(感量0.1 mg)。

2.2.4.3  操作程序

    (1)在有表面活性作用的清洁剂中浸泡10 min，充分去油，洗净； 亦可用氧化镁糊剂涂抹除油后洗净；以120号粒度水砂纸磨去金属片两面和周边表面的氧化层，再用自来水冲净。测量片的直径、厚度、孔径（精确至0.1 mm）。用无水丙酮或无水乙醇再次脱脂。置50℃ 恒温箱中干燥1 h，待其温度降至室温后称重(每金属片待天平回零后称重3次，精确至0.1 mg，取其平均值作为试验前重量。称重时，应戴洁净手套，勿以手直接接触样片。

    (2) 按消毒剂最高使用浓度配制试验用消毒液，用以浸泡试验样片。浸泡时，每一金属片需浸泡在 200 ml 消毒液中。

    (3) 金属样片用塑料线系以标签，编号和注明日期，悬挂于消毒液中。一次性浸泡72 h。易挥发性或有效成分不稳定的消毒剂，根据情况，酌情定时更换消毒液，直至浸泡72 h。

    (4) 每种金属每次试验放置3片样片。浸泡时，若同种金属每一样片相隔1 cm以上，可在同一容器内(含600 ml消毒液) 进行。

    (5) 浸泡到规定时间后，取出金属片，先用自来水冲洗，再用毛刷或其它软性器具去除腐蚀产物。如仍有清除不掉的腐蚀产物，可按GB 10124-88所介绍的下列方法清除:

    铜片: 在室温下浸泡于盐酸溶液(500ml 36%～38% 盐酸加蒸馏水至1000ml，盐酸比重为1.19)中1min～3min。

    碳钢片：置含锌粉200 g/L的氢氧化钠溶液中，煮沸5 min～30 min。

    铝片：浸泡于三氧化铬磷酸溶液(三氧化铬20 g，磷酸500ml，加蒸馏水至1000ml。磷酸比重为1.69)中，升温至80℃，持续5min～10min。如还未清除干净，可在室温浸于硝酸(比重1.42)溶液中1min。

    不锈钢：浸泡于60℃硝酸溶液(66%～68%硝酸100 ml加蒸馏水至1000 ml) 20 min。或浸于70℃柠檬酸铵溶液(柠檬酸铵150 g 加蒸馏水至1000 ml)中10 min～60 min。

    (6) 金属样片除去腐蚀产物并清洗后，用粗滤纸吸干水分，置于垫有滤纸的平皿中，放入50℃ 温箱，干燥1h，用镊子夹取，待其温度降至室温后分别在天平上称重。天平回零后称3 次，以其平均值作为试验后重量。

    称重时，与试验前相同，应戴洁净手套，勿以手直接接触样片 (下同)。

    (7) 样片在用化学法去除腐蚀物时，需设相应空白对照以校正误差。空白对照样片与试验组样片同样进行表面处理、洗净和称重，但不经消毒剂浸泡。事后随同试验组样片用相同方法进行化学处理、水冲洗、干燥、称重，并计算其平均失重值。

    (8) 试验的全过程应同时设不锈钢片浸泡蒸馏水的对照，浸泡前后的重量差应 <0.3 mg。否则，在找出原因后，全部试验重做。

(9) 试验结果，观察与纪录金属片颜色变化，并以金属腐蚀速率(R)平均值表达，在计算时应减去空白对照组样片的失重值。计算公式如下

[R为腐蚀速率，mm/a（毫米/年）；m为试验前金属片重量，g；m_t为试验后金属片重量，g；m_k为化学处理去除腐蚀产物样片失重值，g，试验中未进行化学清除处理者，计算时在公式中删去m_k值；S为金属片的表面积总值，cm²；t为试验时间，h；d为金属材料密度，kg/m³]。

2.2.4.4 腐蚀性分级标准

2.2.4.5  注意事项

    (1) 每张砂纸只能磨一种金属材料。一个容器盛的消毒液只能浸泡同一种金属。

    (2) 称重关系到结果的准确性，必须认真进行。接触样片的器具不得带有油垢。

    (3) 所用金属片大小、厚薄应严格一致，表面需磨光。

    (4) 试验期间，需换消毒剂溶液时，操作应迅速，勿使样片暴露空气中过久。

(5) 金属样片仅可使用一次，否则影响试验的准确性。

(1) 试验在20℃～25^oC条件下进行。

(7)在报告其结果时应对试验后金属样片的外观变化等现象进行描述。

3.15  污物的消毒处理

3.15.1  适用范围

本节所称“污物”是指医疗卫生机构在诊断、治疗、卫生处理过程中产生的废弃物和患者生活过程中产生的排泄物及垃圾，这些废弃物均有病原微生物污染的可能，也可能对公众健康造成危害，本节规范主要提供了对污物消毒的方法和要求，也对医疗卫生机构产生的其他有害废弃物的处理提供了方法。

对医疗卫生机构污物的处理必须符合国家有关法律法规的规定。

3.15.2  污物的分类

医院的大部分废物是没有危害的普通垃圾，不需特别处理；但一旦这些没有危害性的垃圾与其他具有危害性的或传染性的污物混合在一起，就需特殊的搬运和处理。因此对医院污物进行分类是医院污物有效处理的前提。

3.15.2.1 生活垃圾：在医疗卫生机构的管理、建筑物的维修中产生，按城市垃圾处理原则进行处理。

3.15.2.2  感染性废弃物：指可能含有病原菌（细菌、病毒、寄生虫或真菌）的废弃物，其浓度和数量足以对人致病。主要包括以下几类：

（1）实验室所用的菌落及病原株培养基和保菌液；

（2）传染病人手术或尸解后的废弃物（如组织、污染的材料和仪器等）；

（3）来自传染病房的废弃物（如排泄物、手术或感染伤口的敷料、严重污染的衣服）；

（4）传染病人血透析中产生的废弃物（如透析设备、试管、过滤器、围裙、手套等）；

（5）实验室感染的动物；

（6）传染病人或动物接触过的任何其他设备和材料。

（7）使用过的一次性注射器、输液器、输血器等废弃物。

3.15.2.3 病理性废弃物：包括组织、器官、部分躯体、死胎和动物尸体、血液、体液。

3.15.2.4 锋利物（锐器）：指能对人扎伤或割伤的物体，包括针头、皮下注射针、解剖刀、手术刀、输液器、手术锯、碎玻璃及钉子。

3.15.2.5 药物性废弃物：包括过期、被淘汰、压碎或污染的药品、疫苗、血清。

3.15.2.6 遗传毒性废弃物：包括已明确的抑制细胞的药物，化学或放射治疗病人的呕吐物、尿或粪便。如苯、环孢霉素、环磷酰胺等。细胞毒性药物是这类废弃物中的主要物质，能杀死或阻碍特定细胞的生长，用于肿瘤的化疗及在器官移植、免疫性疾病的治疗中作为免疫抑制剂。

3.15.2.7 化学性废弃物：在诊断、试验、清洁、管理、消毒过程中产生的，具有毒性、腐蚀性、易燃性、反应性或遗传毒性的固体、液体、气体。如甲醛、摄影用剂、有机化合物等。

3.15.2.8 放射性废弃物：包括被放射性核素污染了的固体、液体和气体。如低活度的固体废弃物（吸收纸、拖把、玻璃器皿、注射器、小药皿）、放置放射性物质容器内的残余物、诊断剂。

3.15.3  污物的处理原则

3.15.3.1分类收集原则：减少有害有毒废物和带传染性废物的数量，有利废物的回收利用和处理。

3.15.3.2回收利用原则：避免浪费。

3.15.3.3减量化原则：通过重复利用、破碎、压缩、焚烧等手段减少固体废物的体积和数量。

3.15.3.4无公害原则：废物处理必须遵守环保及卫生法规标准要求。

3.15.3.5分散与集中处理相结合的原则：分类收集的废物分别进行处理。

3.15.4  污物的收集

3.15.4.1分类收集

（1）设置三种以上颜色的污物袋，黑色袋装生活垃圾，黄色袋装医用垃圾（感染性废弃物），直接焚烧的污物、放射性废弃物和其他特殊的废弃物使用有特殊标志的污物袋进行收集。使用的污物袋应坚韧耐用、不漏水，并首选可降解塑料制成的污物袋。

（2）医院应建立严格的污物分类收集制度，所有废弃物都应放入标有相应颜色的污物袋（桶）中，应及时清运或在装满3/4时有人负责封袋运送。

（3）锐器不应与其他废弃物混放，用后必须稳妥安全地置入锐器容器中。高危区的医院污物建议使用双层污物袋，并及时密封。放射性废物应存放在适当的容器中防止扩散。

（4）分散的污物袋要定期收集集中。污物袋应每日运出病房或科室，也可根据需要决定搬运时间，并运往指定的收集地点。不能移动未标明废弃物产生地及废弃物种类的污物袋（箱），应立即补充上新的同类的污物袋（箱），以供使用。应防止污物袋（箱）的泄漏。

3.15.4.2医院中心废物存放地

（1）污物袋（箱）在就地处理或异地处理之前，要集中存放在医院中心废物存放地，有害废物和普通垃圾要分开存放，并有明显标识。

（2）存放地应有遮盖设施，防止污染周围环境；设有冲洗及消毒设施，清洗过程的废水应排入医院污水系统。

3.15.5  感染性废弃物的消毒处理

3.15.5.1液体污物：主要指患者吃过的剩饭剩菜、排泄物、呕吐物等。

（1）可作动物饲料的剩饭剩菜，须煮沸30min后才能运出；

（2）没有利用价值的剩饭剩菜和排泄物、呕吐物，加1/5量的漂白粉，搅匀后作用2h，倒入专用化粪池或运出；

（3）特殊传染病病人的排泄物、呕吐物参照3.15.5.3～3.15.5.8执行。

3.15.5.2固体污物

（1）无利用价值的可燃性污物，在条件允许的情况下可采用焚烧处理。

（2）非可燃性固体污物应先消毒，然后根据物品的再利用价值，送废旧物品收购站或城市垃圾处理站。消毒方法可选用含有效氯或有效溴500mg/L～1000mg/L的消毒液、含1000mg/L～2000mg/L二氧化氯的消毒液或0.5%过氧乙酸消毒液浸泡60min。

3.15.5.3感染症病人污物的消毒处理：

（1）病人的粪便加2倍量10%～20%漂白粉乳液；呕吐物加1/5量干漂白粉，搅匀后加盖作用2h，再倒入厕所。

（2）伤寒病人的尿液每100ml加漂白粉3g，搅匀后加盖，作用2h。

（3）患者使用过的便器用1%漂白粉上清液、含有效氯2000 mg/L的消毒液、0.5%过氧乙酸浸泡30min。

（4）病毒性肝炎病人衣物可用具有消毒杀菌作用的洗涤剂进行浸泡清洗；也可采用甲醛、环氧乙烷进行薰蒸消毒。

（5）结核病人的痰盒收集后焚烧；也可加等量10%～20%漂白粉乳液（或1/5量的干粉），作用2h～4h或加等量1%过氧乙酸作用30 min～60min。

（6）真菌病人使用过的毛巾、衣物等可用含0.2%过氧乙酸溶液浸泡30min后清洗；也可采用上述（4）的方法薰蒸。

（7）无经济价值的可燃性污物采用焚烧处理。

3.15.5.4炭疽病人污物的消毒处理

（1）尽可能都采用焚烧处理。不能焚烧的，用含有效氯或有效溴2000mg/L的消毒液或2%戊二醛浸泡、擦拭30 min～60min。

（2）肠炭疽病人排泄物按3.15.5.3（1）处理，但作用时间需延长至6h；病人所用便器按3.15.5.3（3）处理，但使用药物浓度应加倍。

3.15.5.5艾滋病病人污物的消毒处理

（1）无经济价值的可燃性污物采用焚烧处理。

（2）病毒携带者和病人分泌物、排泄物用20%漂白粉乳液1：2混合后作用2h。

（3）液体污物可煮沸30min；也可加入含氯消毒剂（使混合液中有效氯达到1000mg/L）、或过氧乙酸（使混合液中达到5000mg/L）作用30min。

（4） 病人使用过的衣物、床单等可装入防水口袋内，外加一布袋后采用压力蒸汽消毒；也可直接煮沸30min。对被血液或排泄物明显污染的衣物，采用含有效氯1000mg/L的消毒液浸泡30min处理。

3.17  医院消毒灭菌的效果监测

3.17.1 前言

医院消毒是预防医院内感染的重要措施之一，消毒效果的监测是评价其消毒设备运转是否正常、消毒药剂是否有效、消毒方法是否合理、消毒效果是否达标的唯一手段，因而在医院消毒、灭菌工作中必不可少。

医院消毒效果监测时需遵循以下原则：监测人员需经过专业培训，掌握一定的消毒知识，熟悉消毒设备和药剂性能，具备熟练的检验技能；选择合理的采样时间(消毒后、使用前)；遵循严格的无菌操作。

3.17.2 热力灭菌效果的监测方法

3.17.2.1 压力蒸汽灭菌效果监测方法

（1） 化学监测法：

1）化学指示卡(管)监测方法: 将既能指示蒸汽温度，又能指示温度持续时间的化学指示管(卡) 放入大包和难以消毒部位的物品包中央，经一个灭菌周期后，取出指示管(卡)，根据其颜色及性状的改变判断是否达到灭菌条件。

2）化学指示胶带监测法: 将化学指示胶带粘贴于每一待灭菌物品包外，经一个灭菌周期后，观察其颜色的改变，以指示是否经过灭菌处理

3）对预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌，每日进行一次B-D试验。

4）结果判定: 检测时，所放置的指示管(卡)、胶带的性状或颜色均变至规定的条件，判为灭菌合格；若其中之一未达到规定的条件，则灭菌过程不合格。

5）注意事项: 监测所用化学指示物须经卫生部批准，并在有效期内使用。

（2） 生物监测法

1）指示菌株: 指示菌株为耐热的嗜热脂肪杆菌芽孢(ATCC 7953 或 SSIK 31株)，菌片含菌量为 5.0×10⁵ cfu/片～5.0×10⁶cfu/片，在 121℃±0.5℃条件下，D值为 1.3 min～1.9min，杀灭时间(KT值)≤19min，存活时间(ST值)为≥3.9min。

2）培养基: 试验用培养基为溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基。

3）检测方法: 将两个嗜热脂肪杆菌芽孢菌片分别装入灭菌小纸袋内，置于标准试验包中心部位。

再下排气压力蒸汽灭菌器灭菌柜室内，排气口上方放置一个标准试验包(由 3 件平纹长袖手术衣，4 块小手术巾，2 块中手术巾，1 块大毛巾，30 块 10cm×250px 8 层纱布敷料包裹成 625px×30cm×30 大小)；预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌器灭菌柜室内，排气口上方放置一个标准测试包（由16条全棉手术巾每条41cm×66cm，将每条手术巾的长边先折成3层，短边折成2层然后叠放，作成23cm×23cm×15cm大小的测试包）；手提压力蒸汽灭菌器用通气贮物盒（250px×13cm×150px) 代替标准试验包，盒内盛满中试管，指示菌片放于中心部位的两只灭菌试管内(试管口用灭菌牛皮纸包封)，将贮物盒平放于手提压力蒸汽灭菌器底部。

经一个灭菌周期后，在无菌条件下，取出标准试验包或通气贮物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，经 56℃±1℃培养 7d(自含式生物指示物按说明书执行)，观察培养基颜色变化。检测时设阴性对照和阳性对照。

4）结果判定: 每个指示菌片接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基都不变色，判定为灭菌合格；指示菌片之一接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基，由紫色变为黄色时，则灭菌过程不合格。

5）注意事项: 监测所用菌片须经卫生部认可，并在有效期内使用。生物指示物监测应1月1次。

3.17.2.2 干热灭菌效果监测方法

（1）化学检测法

1）检测方法:将既能指示温度又能指示温度持续时间的化学指示剂 3个～5 个分别放入待灭菌的物品中，并置于灭菌器最难达到灭菌的部位。经一个灭菌周期后，取出化学指示剂，据其颜色及性状的改变判断是否达到灭菌条件。

2）结果判定：检测时，所放置的指示管的颜色及性状均变至规定的条件，则判为达到灭菌条件；若其中之一未达到规定的条件，则判为未达到灭菌条件。

3）注意事项：检测所用的化学指示剂需经卫生部认可，并在有效期内使用。

（2）物理检测法:(热电偶检测法)

1）检测方法:检测时，将多点温度检测仪的多个探头分别放于灭菌器各层内、中、外各点。关好柜门，将导线引出，由记录仪中观察温度上升与持续时间。

2）结果判定：若所示温度（曲线）达到预置温度，则灭菌温度合格。

（3）生物检测法

1）指示菌株：枯草杆菌黑色变种芽孢（ATCC 9372），菌片含菌量为 5.0×10⁵ cfu/片～5.0×10⁶cfu/片。其抗力应符合以下条件：在温度 160℃±2℃ 时，其 D 值为 1.3 min～1.9min，存活时间 ≥3.9min，死亡时间 ≤19min。

2）检测方法：将枯草杆菌芽孢菌片分别装入灭菌中试管内（ 1 片/管）。灭菌器与每层门把手对角线内，外角处放置2个含菌片的试管，试管帽置于试管旁，关好柜门，经一个灭菌周期后，待温度降至 80℃时，加盖试管帽后取出试管。在无菌条件下，加入普通营养肉汤培养基（5ml/管），以 36℃±1℃ 培养 48h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第七日。

3）结果判定：若每个指示菌片接种的肉汤管均澄清，判为灭菌合格，若指示菌片之一接种的肉汤管混浊，判为不合格，对难以判定的肉汤管，取 0.1ml 接种于营养琼脂平板，用灭菌L棒涂匀，放36℃±1℃ 培养48h，观察菌落形态，并做涂片染色镜检，判断是否有指示菌生长，若有指示菌生长，判为灭菌不合格；若无指示菌生长，判为灭菌合格。

4）注意事项：检测所用的指示菌片需经卫生部认可，并在有效期内使用

3.17.3 环氧乙烷（EO）灭菌效果监测

3.17.3.1 灭菌效果监测

每次灭菌均应进行程序监测。每个灭菌物品的外包装应粘贴包外化学指示胶带，作为灭菌过程的标志; 包内放置化学指示卡，作为灭菌效果的参考。每月应做生物监测，移植物必须等生物监测结果为阴性时方可使用。具体做法，环氧乙烷测试包分挑战性测试包和常规测试包，前者主要用于对灭菌器的考核，后者作为平时的常规生物监测之用。挑战性测试包是将一生物指示剂放于一个20ml注射器内，去掉针头和针头套，生物指示剂带孔的塑料帽应朝注射器针头处，再将注射器芯放在原位(注意不要碰及生物指示物)；另选一成人型气管插管或一个塑料注射器(内含化学指示卡)，一个琥珀色乳胶管(25.4cm长，19px内径，1.6mm管壁厚)和4条全棉清洁手术巾(46cm×76cm)，每条巾单先折叠成3层，再对折，即每条巾单形成6层，然后将叠好的巾单从下至上重叠在一起，再将上述物品放于巾单中间层，最后选两条清洁布或无纺布包裹，用化学指示胶带封扎成一个测试包。常规测试包的制备方法类似，先将一生物指示剂放于一个注射器内(同前)，再用一条全棉小毛巾两层包裹，一起放入一剥离式包装袋内。

3.17.3.2仪器监测法

按照GB 18279-2000 医疗器械  环氧乙烷灭菌确认和常规控制 附录 C 中C3.1的要求进行。

3.17.3.3化学监测法

每次消毒过程均用化学指示物监测，只有当消毒工艺符合要求，化学指示物变色符合规定标准色要求的情况下，产品才可放行。

3.17.3.4 生物指示物监测法

一般每月用生物指示物监测一次。生物指示物用枯草杆菌黑色变种芽孢（ATCC 9372），抗力要求为：菌量在5×10⁵cfu/片～5×10⁶cfu/片，在环氧乙烷剂量为600mg/L±30mg/L，作用温度为54℃±2℃，相对湿度为60%±10%条件下，其杀灭90%该微生物的D值为2.6min～5.8min，存活时间应≥7.8min，死亡时间应≤58min。

在消毒效果用该微生物监测时，菌量为5×10³cfu/片～5×10⁴cfu/片。放置菌片的数量应足够多。根据通常做常规微生物学监测的实践经验，采用以下数量的生物指示物较为适宜：

①灭菌器柜室可用体积小于5m³时，至少放置10个菌片；

②灭菌器柜室可用体积为5m³至10m³时，每增加1m³，增加1个菌片；

③灭菌器柜室可用体积大于10m³时，每增加2m³，增加1个菌片。

生物指示物应放在那些在性能鉴定时发现是最难灭菌的部位，并均匀分布于整个灭菌物品中。生物指示物应在预处理之前放入被灭菌物品内或被灭菌物品的试件内。应尽量在灭菌周期完成后立即将生物指示物从被灭菌物品中取出并进行培养。应确定任何延迟复苏，特别是暴露于残留EO气体中的影响。所以，取出的指示菌片接种于含有复方中和剂的0.5%的葡萄糖肉汤培养基管中，以未经处理的阳性菌片做相同接种，两者均置于36℃±1℃培养。

3.17.3.5 每次灭菌都应进行灭菌过程监测。见3.2.6.5。

3.17.3.6 结果判定：经培养，阳性对照在24h内有菌生长；监测样品若连续培养观察5天，全部无菌生长，可报告生物指示物培养阴性，灭菌合格。

3.17.3.7 注意事项：检测所用化学和微生物指示物必须经卫生部批准，并在有效期内使用。

3.17.4 紫外线消毒效果的监测

3.17.4.1 紫外线灯管辐照度值的测定

（1）检测方法:

1）紫外线辐照计测定法：开启紫外线灯 5min 后，将测定波长为 253.7nm 的紫外线辐照计探头置于被检紫外线灯下垂直距离 1m 的中央处，待仪表稳定后，所示数据即为该紫外线灯管的辐照度值。

2）紫外线强度照射指示卡监测法：开启紫外线灯5min后，将指示卡置紫外灯下垂直距离1m处，有图案一面朝上，照射1min（紫外线照射后，图案正中光敏色块由乳白色变成不同程度的淡紫色），观察指示卡色块的颜色，将其与标准色块比较，读出照射强度。

（2）结果判定: 普通 30w 直管型紫外线灯，新灯辐照强度 ≥90μW/cm²为合格；使用中紫外线灯辐照强度≥70μW/cm² 为合格；30W 高强度紫外线新灯的辐照强度≥180μW/cm² 为合格。

（3）注意事项: 测定时电压 220V±５V，温度 20℃～25℃，相对湿度＜60％，紫外线辐照计必须在计量部门检定的有效期内使用；指示卡应获得卫生许可批件，并在有效期内使用。

3.17.4.2 生物监测法

（1）空气消毒效果监测:按 3.17.8的原则执行。

（2）表面消毒效果监测:监测按3.17.7的原则执行。

（3）注意事项: 紫外线消毒效果监测时，采样液(平板)中不加中和剂。

3.17.5 医疗器械灭菌效果的监测

3.17.5.1 采样时间: 在灭菌处理后，存放有效期内采样。

3.17.5.2 无菌检验

无菌检验是指检查经灭菌的敷料、缝线、一次性使用的医疗用品、无菌器械以及适合于无菌间查的其它品种是否无菌的一种方法。

无菌检验应在洁净度为100级单向流空气区域内进行，应严格遵守无菌操作，避免微生物污染；对单向流空气区域及工作台面，必须进行洁净度验证。

（1） 无菌检验前准备

1）洗脱液与培养基无菌性试验:无菌试验前 3d，于需-厌养培养基与霉菌培养基内各接种 1ml 洗脱液，分别置 30℃～35℃与 20℃～25℃培养 72h，应无菌生长。

2）阳性对照管菌液制备:

 ①在试验前一天取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的普通琼脂斜面新鲜培养物，接种1环至需-厌氧培养基内，在 30℃～35℃培养 16h～18h 后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 cfu/ml～100cfu/ml;

②取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氧菌、厌氧菌培养基新鲜培养物1接种环种于相同培养基内，于30℃～35℃培养 18h～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 cfu/ml～100cfu/ml;

 ③取白色念珠菌[CMCC（F）98001]真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1接种环种于相同培养基内，于20℃～25℃培养 24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10cfu/ml～100cfu/ml。

（2）无菌操作: 取缝合针、针头、刀片等小件医疗器械5件直接浸入 6 管需-厌氧培养管(其中一管作阳性对照)与 4 管霉菌培养管。 培养基用量为 15ml/管。

1)取5付注射器，在 5ml 洗脱液中反复抽吸 5 次，洗下管内细菌，混和后接种需-厌养菌培养管(共 6 管，其中 1 管作阳性对照)与霉菌培养管(共 4 管)。 接种量：1ml注射器为 0.5ml，2ml注射器为 1ml，5ml～10ml 注射器为 2ml，20ml～50ml注射器为 5ml，培养基用量：接种量为 2ml 以下为 15ml/管，接种量5ml为 40ml/管。

2)手术钳、镊子等大件医疗器械取 2 件用沾有无菌洗脱液的棉拭子反复涂抹采样，将棉拭子投入 5ml 无菌洗脱液中，将采样液混匀，接种于需-厌氧培养管(共 6 管，其中 1 管作阳性对照)与霉菌培养基(共 4 管)。接种量为 1ml/管，培养基用量为 15ml/管。

（3）培养:在待检样品的需-厌氧培养管中，接种预先准备的金黄色葡萄球菌阳性对照管液 1:1000 稀释 1ml，将需-厌氧培养管以及阳性与阴性对照管均于 30℃～35℃培养 5d，霉菌培养管与阴性对照管于 20℃～25℃培养 7d，培养期间逐日检查是否有菌生长，如加入供试品后培养基出现混浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取培养液转种入另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养 48h～72h 后，观察是否再现混浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片染色，用显微镜观察是否有菌生长。

（4）结果判定:阳性对照在 24h 内应有菌生长，阴性对照在培养期间应无菌生长，如需-厌氧菌及霉菌培养管内均为澄清或虽显混浊但经证明并非有菌生长，判为灭菌合格；如需-厌氧菌及霉菌培养管中任何1管显混浊并证实有菌生长，应重新取样，分别同法复试 2 次，除阳性对照外，其他各管均不得有菌生长，否则判为灭菌不合格。

3.17.5.3 注意事项

（1）送检时间不得超过 6h，若样品保存于 0℃～4℃，则不得超过24h。

（2）被采样本表面积＜2500px²取全部表面；被采样本表面积≥2500px²，取 2500px²。

（3）若消毒因子为化学消毒剂，采样液中应加入相应中和剂。

3.17.5.4  热原检查法:

（1）鲎试验

本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。细菌内毒素国家标准品（以下简称RSE）系自大肠杆菌提取精致得到的内毒素。以细菌内毒素国际标准品为基准，经过协作标定，使其与国际标准品单位含义一致。RSE用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品（以下简称CSE）。CSE系经RSE为基准进行标定，确定其重量的相当效价。每毫微克（1ng）CSE的效价应不小于 2EU，不大于 50EU，并具备均一性和稳定性的实验数据。CSE 用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的阳性对照。

1）试验准备：试验所用器皿，需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少 1h 或 180℃干烤至少2h，也可用其他适宜的方法。试验所用器皿应确证无吸附细菌内毒素的作用。试验操作过程应防止微生物的污染。

2）鲎试剂灵敏度复核：根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将RSE或CSE用细菌内毒素检查用水（与批号鲎试剂 24h 不产生凝集反应的灭菌注射用水，以下简称BET水）溶解，在旋涡混合器上混合 15min，然后制备成 2.0λ、1.0λ、0.5λ和 0.25λ等 4 个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合 30s，按“检查法”项下试验，每一浓度平行做4管，同时用 BET 水做 4 管阴性对照，如最大浓度（2.0λ）4 管为阳性，最低浓度（0.25λ）4 管均为阴性，阴性对照 4 管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值（λ_c）。

4.1常用消毒方法

4.1.1煮沸消毒法

4.1.1.1适用范围：餐（饮）具、服装、被单等不耐湿、耐热物品的消毒。

4.1.1.2操作方法及注意事项：煮锅内的水应将物品全部淹没。水沸开始计时，持续15 min～30min。计时后不得再新加入物品，否则持续加热时间应从重新加入物品再次煮沸时算起。亦可用0.5%肥皂水，或1%碳酸钠溶液代替清水，以增强消毒效果。

4.1.2消毒剂溶液浸泡消毒法

4.1.2.1适用范围：餐（饮）具、服装、污染的医疗用品等的消毒。

4.1.2.2操作方法及注意事项：消毒剂溶液应将物品全部浸没。对导管类物品，应使管腔内也充满消毒剂溶液。作用至规定时间后，取出用清水冲净，晾干。根据消毒剂溶液的稳定程度和污染情况，及时更换所用溶液。

4.1.3消毒剂溶液擦拭消毒法

4.1.3.1适用范围：家具表面的消毒。

4.1.3.2操作方法及注意事项：用布浸以消毒剂溶液，依次往复擦拭被消毒物品表面。必要时，在作用至规定时间后，用清水擦净以减轻可能引起的腐蚀作用。

4.1.4消毒剂溶液喷雾消毒法

4.1.4.1适用范围：室内空气、居室表面和家具表面的消毒。

4.1.4.2操作方法及注意事项：

4.1.4.2.1普通喷雾消毒法

用普通喷雾器进行消毒剂溶液喷雾，以使物品表面全部润湿为度，作用至规定时间。喷雾顺序宜先上后下，先左后右。喷洒有刺激性或腐蚀性消毒剂时，消毒人员应戴用防护口罩和眼镜，并将食品、食（饮）具及衣被等物收放好。

4.1.4.2.2气溶胶喷雾消毒法 

喷雾时，关好门窗，喷距以消毒剂溶液能均匀覆盖在物品表面为度。喷雾结束30min～60min后，打开门窗，散去空气中残留的消毒剂雾粒。对消毒人员和物品的防护，同普通喷雾消毒法，尤其应注意防止消毒剂气溶胶进入呼吸道。

4.1.5环氧乙烷简易薰蒸消毒法

4.1.5.1适用范围：棉衣、书信、皮革制品、电器及电子设备等耐湿、热和易被腐蚀物品的消毒。

4.1.5.2操作方法及注意事项：将物品放入丁基橡胶消毒袋中，排尽袋中空气，扎紧袋口。通入环氧乙烷气体。待作用至规定时间(16h～24h)，于通风处打开消毒袋，取出物品，使残留环氧乙烷自然消散。环氧乙烷为易燃易爆药品，使用过程中室内不得有明火或产生电火花。本法不得用于对房间的消毒。

4.2消毒面积与体积的测算

取卷尺，一人牵卷尺一端，固定在墙壁一角，另一人拉动卷尺测出室内墙壁的周长（m）。在测算面积时，除空气传播传染病对墙壁消毒的高度需到顶外，其他传染病对墙壁消毒的高度均为2 m。

4.3消毒剂的应用

4.3.1消毒剂的杀菌水平

4.3.1.1高效消毒剂包括戊二醛、过氧乙酸、二溴海因、二氧化氯和含氯消毒剂[漂白粉、次氯酸钠、次氯酸钙（漂粉精）、二氯异氰尿酸钠（优氯净）、三氯异氰尿酸]等。

4.3.1.2中效消毒剂包括含碘消毒剂（碘伏、碘酊）、醇类及其复配消毒剂、酚类消毒剂等。

4.3.1.3低效消毒剂包括苯扎溴铵、苯扎氯铵等季铵盐类消毒剂，醋酸氯已定、葡萄糖酸氯己定等双胍类消毒剂等。

4.3.2常用消毒剂

用于疫源地消毒的消毒剂应具备消毒剂批准文号，使用前应详细阅读产品使用说明书，明确有效期、使用方法和注意事项。必要时按2.2.1.2要求进行含量检测。常用疫源地消毒用消毒剂的特点如下：

4.3.2.1漂白粉

是一种混合物，代表分子式CaOCl₂，主要成分是次氯酸钙，还有氢氧化钙、氯化钙、氧化钙。漂白粉为白色颗粒状粉末，有氯臭，溶于水，在光照、热、潮湿环境中极易分解。漂白粉含有效氯25%左右。

4.3.2.1.1杀菌能力：革兰阳性和阴性细菌对含氯消毒剂均高度敏感，真菌和抗酸杆菌中度敏感；高浓度时，亲脂、亲水病毒及芽孢亦敏感。

4.3.2.1.2影响因素

(1) 酸碱度：溶液pH越高，杀菌作用越弱。pH升至8以上，可失去杀菌活性。

(2）有机物：可消耗有效氯，明显影响含氯消毒剂的杀菌作用，尤其是消毒液浓度较低时，这种影响更为明显。

(3)温度：每升高10℃，杀菌时间可缩短50%～60%。

4.3.2.1.3剂型和使用方法：使用漂白粉前应测定有效氯的含量。有效氯含量用%(W/W)表示。用漂白粉配制水溶液时应先加少量水，调成糊状，然后边加水边搅拌成乳液，静置沉淀，取澄清液。漂白粉干粉可用于铺垫墓葬，地面和人、畜排泄物的消毒，其水溶液可用于餐具消毒、饮水消毒、污水处理、粪便处理、用具擦拭消毒等。

4.3.2.1.4注意事项：应依测定的有效氯含量，按测定浓度用药。要注意漂白粉对织物的漂白作用和对各类物品如金属制品的腐蚀作用，操作时应做好个人防护。漂白粉应保存在密闭容器内，放在阴凉、干燥、通风处。

4.3.2.2次氯酸钙（漂粉精）

分子式Ca（OCl）₂ ，分子量197.029。白色粉末，比漂白粉易溶于水且稳定，含杂质少，受潮易分解。有效氯含量为80%～85%。影响因素、使用方法和注意事项与漂白粉相同。.

4.3.2.3二氯异氰尿酸钠(优氯净)

分子式为C₃O₃N₃Cl₂N₂ ，分子量为219.95。白色晶粉，含有效氯60%左右，性质稳定，即使贮存于高温高湿条件下，有效氯也丧失极少。溶解度为25%，水溶液的稳定性较差，在20℃下，3d丧失有效氯5%～7%，7d丧失20%。当温度升至30℃时，1周可丧失50%。

4.3.2.3.1杀菌能力：二氯异氰尿酸钠杀菌谱广，对细菌繁殖体、病毒、真菌孢子及细菌芽孢都有较强杀灭作用。

4.3.2.3.2影响因素

（1）温度：温度低时可降低二氯异氰尿酸钠的杀菌作用。

（2）酸碱度：酸性条件下的杀菌作用要比碱性条件下强。

（3）有机物：可降低二氯异氰尿酸钠的杀菌能力。

4.3.2.3.3剂型和使用方法：与漂白粉相同，如水溶液可用于喷洒、浸泡、擦拭消毒。干粉可用于人、畜排泄物和地面的消毒。

4.3.2.3.4注意事项：使用时应注意其腐蚀和漂白作用。操作时应做好个人防护。应保存在密闭容器内，放在阴凉、干燥、通风处。

4.3.2.4环氧乙烷

分子式为C₂H₄O，分子量为44.05。沸点为108℃，冰点为-111.3℃，比空气重。液体环氧乙烷可与水任意比例混合，液体可溶解某些塑料。它的蒸汽压较大，对物品的穿透力强。高浓度环氧乙烷遇明火可发生爆炸。

4.3.2.4.1杀菌能力：几乎各种微生物对环氧乙烷敏感，而且细菌繁殖体和芽孢之间对环氧乙烷的敏感性差异很小，这是环氧乙烷作为灭菌剂的一个特点。

4.3.2.4.2影响因素：环氧乙烷杀菌作用主要影响因素是温湿度、药物浓度和微生物的状态。

(1）温度和浓度的影响彼此相关，例如温度在45℃～60℃范围内，浓度高于450mg/L，再提高浓度不能改变所需灭菌时间。一般来说，45℃，450mg/L已发挥药物的最大作用。但是实际应用中，还应考虑药物穿透包装材料时的吸收消耗，宜适当加大药物的用量，提高温度。

(2) 湿度对环氧乙烷的杀菌作用有明显影响，一般以RH 60%～80%为宜。

(3）消毒对象对消毒效果亦有明显影响，有些材料可吸收大量环氧乙烷，对于大量吸收环氧乙烷的物品应相应加大剂量。

4.3.2.4.3注意事项

(1) 环氧乙烷消毒过程中应注意防火防爆。

(2）要防止灭菌消毒袋、柜泄漏，以保证消毒过程中环氧乙烷的浓度并避免污染环境，要控制温湿度。

(3）不适用于饮水和食品消毒。

4.3.2.5过氧乙酸

分子式为C₂H₄O₃，分子量为76.0518。液体透明，弱酸性，易挥发，沸点110℃。贮存过程中易分解，尤其有重金属离子或遇热时极易分解。高浓度和高温度可引起过氧乙酸爆炸，浓度在20%以下一般无爆炸的危险。

4.3.2.5.1杀菌能力：过氧乙酸可杀灭各种微生物，温度在0℃以下时，仍可保持活性。其杀菌作用强弱的顺序依次为细菌繁殖体、真菌、病毒、结核杆菌（分枝杆菌）和细菌芽孢。

4.3.2.5.2影响因素

（1）温度：一般说来，温度越高过氧乙酸的杀菌力越强，但温度降至-20℃时，过氧乙酸仍有明显杀菌作用。

（2）湿度：当过氧乙酸喷雾消毒时，空气的相对湿度在20%～80%时，湿度越大，杀菌效果越好。当相对湿度低于20%时，则杀菌作用较差。

（3）浓度和作用时间：过氧乙酸的杀菌作用随浓度的增高、时间的延长而增强。

（4）有机物：在用过氧乙酸消毒时，有机物对细菌繁殖体的保护作用较芽孢为明显，但是这种保护作用因菌种和有机物的种类及浓度的不同而有所不同。

4.3.2.5.3应用：0.1%的过氧乙酸1min～10min可杀灭细菌繁殖体；0.5%的过氧乙酸5min可杀灭结核杆菌和真菌，30min可杀灭枯草杆菌芽孢。溶液可用于浸泡消毒餐(饮)具、便器、体温计及医务人员手等。过氧乙酸气雾浓度达到1g/m³时，可杀灭物体表面的芽孢，可用于墙壁、地板、家具消毒。

4.3.2.5.3注意事项

（1）过氧乙酸性质不稳定，其稀溶液极易分解。因此，应于用前配制。配制的稀溶液应盛于塑料容器中，避免接触金属离子。

（2）对多种金属和织物有强烈的腐蚀和漂白作用，使用时应注意。

（3）接触高浓度过氧乙酸时，工作人员应采取防护措施。物品用过氧乙酸消毒后，应放置1 h～2h，待残留在物体表面上的过氧乙酸挥发、分解后使用。

4.3.2.6碘伏

碘伏是碘与表面活性剂（如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙氧基乙醇）的不定型结合物，如聚乙烯吡咯烷酮—碘大约含有10%（W/W）碘。由于表面活性剂起到碘的载体和助溶作用，使碘伏溶液逐渐释放碘，延长了碘的杀菌作用时间。碘伏具有广谱杀菌作用，刺激性小，毒性低，无腐蚀性（除银、铝和二价合金）和性质稳定便于贮存等优点，而且碘伏的颜色深浅与杀菌作用成正比，便于判断其杀菌能力。

4.3.2.6.1杀菌能力：革兰阳性和阴性细菌对碘伏都高度敏感，抗酸杆菌，细菌芽孢、亲脂病毒及亲水病毒等都敏感。

4.3.2.6.2影响因素：碘伏在酸性和中性条件下杀菌效果最佳，软水或硬水均可用来配制碘伏溶液。有机物对其杀菌作用的影响明显比氯小，温度超过40℃可使其成为碘蒸汽。

4.3.2.6.3注意事项：

(1) 稀释液不稳定，2d后有效碘可降低50%，因此宜在使用前配制。

(2) 避免接触银、铝和二价合金。

(3) 在用于皮肤消毒时，碘伏虽比游离碘溶液引起过敏反应的频率低、反应轻，但用于敏感组织仍需慎重。

4.3.2.7苯扎溴铵

分子式为C₂₁H₃₈NBr ，分子量为384.46。具有芳香味，呈淡黄色胶状，易溶于水，具有表面活性作用，振摇可产生大量泡沫。

4.3.2.7.1杀菌能力：对化脓性病原菌有良好杀灭作用，对革兰阳性菌的杀灭作用要大于阴性细菌。

4.3.2.7.2注意事项：

(1) 苯扎溴铵与其他季胺盐类一样，极易被多种物体吸附，浸泡液的浓度可随消毒物品数量增多而逐渐降低，因此应该及时更换消毒液。

(2) 不得与肥皂或其它阴离子洗涤剂合用。

(3)不宜用于粪、尿、痰等的消毒。

4.3.2.8氯己定

分子式为C22H30N10Cl2·H2Cl，分子量为578.4。氯己定是阳离子双缩胍，碱性，可与有机酸、无机酸形成盐类，如双醋酸氯己定、双盐酸氯己定和葡萄糖酸氯己定等。氯己定性质稳定，难溶于水。盐酸盐基本上不溶于水而溶于醇，醋酸盐和葡萄糖酸的水中溶解度依次增加。

4.3.2.8.1杀菌能力：氯己定对革兰阳性细菌的杀灭作用较革兰阴性细菌大。

4.3.2.8.2影响因素与注意事项：

(1)pH在5.5～8.0范围内氯己定具有杀菌活性，偏碱时活性较佳，pH高于8.0时，则出现游离碱基沉淀。

(2)阴离子去污剂、肥皂可与氯己定反应，使其失活。

(3)有机物对氯己定杀菌活性有明显影响，阴离子表面活性剂对其有拮抗作用，所以不可与肥皂合用。

(4)氯己定不可用于芽孢、分枝杆菌及亲水病毒的消毒。

4.3.2.9二溴海因

二溴海因的化学名为二溴二甲基乙内酰脲，是一种释放有效溴的消毒剂，加有助溶剂的国产二溴海因消毒剂有效溴含量50％。易溶于水，使用时用去离子水配成所需浓度的消毒液。可用于饮用水、餐饮具、果蔬和各种物体表面等的消毒。

4.3.2.9.1杀菌能力：能杀灭各种微生物，包括细菌繁殖体、病毒、真菌、分支杆菌和芽孢

4.3.2.9.2影响因素与注意事项

(1)二溴海因较不稳定，应用液应在使用时配制，并注意有效期。浸泡消毒时宜加盖。

(2)对金属有一定的腐蚀作用，必要时可添加少量防腐剂。

(3)有机物对其杀菌作用有一定影响，一些金属离子可影响消毒效果。

(4)用于果蔬消毒和餐饮具消毒时，在消毒完成后应用清水冲洗。

4.3.2.9.3应用：对一般细菌繁殖体和病毒污染的物品，用100mg/L～200mg/L二溴海因，作用30min，对结核分支杆菌和致病性芽孢菌污染的物品，用1000mg/L～2000mg/L浓度，作用30min。干扰物较多时应加大剂量。对污水消毒时，视水质污染情况而定，用量一般为5mg/L～10mg/L，作用30min。

4.3.2.10二氧化氯

分子式为ClO₂，性质极不稳定，常在临使用时生产或在二氧化氯稳定液中加入活化剂。二氧化氯的杀菌作用具有广谱、高效、速效等特点，用于饮用水消毒时，一般认为其不产生三卤化物，是一种较含氯消毒剂更安全的新型消毒剂。

4.3.2.10.1杀菌能力：能杀灭各种微生物，包括细菌繁殖体、病毒、真菌、分支杆菌和芽孢等。4.3.2.10.2影响因素和注意事项

（1）消毒效果易受有机物影响。

（2）pH质明显影响消毒效果，pH值高时消毒能力下降。

（3）二氧化氯活化液和稀释液不稳定，应现配现用。

（4）对金属有腐蚀性，对织物有漂白作用，消毒完成后应及时清洗。

4.3.2.10.3应用：适用于医疗器械、餐（茶）具、饮用水及环境表面等消毒。常用消毒方法有浸泡、擦拭、喷洒等。对细菌繁殖体污染的物品进行消毒时，剂量为100mg/L作用30min，对肝炎病毒和结核杆菌污染物品进行消毒时，剂量为500mg/L作用30min，对细菌芽孢污染物品进行消毒时，剂量为1000mg/L作用30min。用于饮用水消毒时，剂量为5mg/L作用5min。

4.3.2.11臭氧

分子式为O₃，是一种强氧化剂，在常温下为爆炸性气体。其密度为1.68。在水中的溶解度较低，约为3%。臭氧具有杀菌迅速，消毒后无残留等优点，因此适于用于饮用水、果蔬、餐饮具等的消毒。臭氧稳定性极差，在常温下可自行分解为氧，所以，臭氧不能瓶装贮备，只能现场生产，立即使用。

4.3.2.11.1杀菌能力：臭氧可杀灭细菌繁殖体、病毒、真菌等，并可破坏肉毒杆菌毒素。

4.3.2.11.2影响因素和注意事项

（1）多种因素可影响臭氧的杀菌作用，包括温度、相对湿度、有机物、pH、水的浑浊度、水的色度等。

（2）高浓度臭氧对人有毒，大气中允许浓度为0.2mg/m³，工作场所允许浓度为1.0mg/m³。（3）臭氧为强氧化剂，对多种物品有损坏，浓度越高对物品损害越重，可使铜片出现绿

色锈斑；可使橡胶老化变色，弹性降低，以致变脆、断裂；可使织物漂白褪色。

（4）臭氧对物品表面上污染的微生物有杀灭作用，但作用缓慢。

4.3.2.11.3应用：臭氧适于用于饮用水、果蔬、餐饮具等的消毒。也可用于各种物品表面消毒和空气消毒。水消毒时一般加臭氧量 0.5 mg/L～1.5mg/L，水中臭氧浓度在0.1 mg/L～0.5mg/L，维持5min～10min。对于质量较差的水，加臭氧量可提高到3mg/L～6mg/L。空气消毒时一般可采用30mg/m³ 的臭氧，作用15min～30min。臭氧水用于果蔬、餐饮具和其他物体表面消毒时，臭氧浓度>12mg/L，作用时间15min～20min。

4.3.3消毒剂浓度的表示方法

4.3.3.1消毒剂溶液浓度

消毒剂溶液浓度的表示应以有效成分的含量为准。常用百分浓度和百万分浓度表示。

4.3.3.1.1百分浓度：每一百份消毒剂溶液中含有效成分的份数，符号是“%”。百分浓度中的重量百分浓度即100g消毒剂溶液中含有效成分的克数。容量百分浓度即100 ml消毒剂溶液中含有效成分的毫升数。

(2)百万分浓度：每一百万份消毒剂溶液中，含有效成分的份数，单位是mg/L。

4.3.3.2消毒剂固体制剂浓度

以百分含量表达 (见4.3.3.1)。

4.3.3.3气体中消毒剂含量

以消毒剂有效成分在气体中的含量为准，一般以mg/L或g/m³为单位表达。

4.3.4主要消毒剂有效成分含量测定法

4.3.4.1目的

测定消毒剂有效成分实际含量，用于检查消毒剂原药是否合格，或所配消毒液中杀菌有效成分的含量是否准确。此外，还可在配制所需浓度消毒液时作为计算稀释倍数的依据。

4.3.4.2消毒剂含量测定

4.3.4.2.1有效氯含量的测定：见2.2.1.2.1。

4.3.4.2.2有效碘含量的测定：见2.2.1.2.2。

4.3.4.2.3过氧乙酸（C₂H₄O₃）含量的测定：见2.2.1.2.3。

4.4紫外线强度及消毒剂浓度简易测定法

4.4.1紫外线强度照射指示卡

4.4.1.1适用范围：监测紫外线灯管在垂直1m处的照射强度。

4.4.1.2使用方法：

(1)开启紫外线灯5min后，将化学卡置紫外线灯下垂直距离1m处，有图案一面朝上。

(2)照射1min(紫外线照射后，图案正中光敏色块由乳白色变成不同程度的淡紫色)。

(3)观察指示卡色块的颜色，将其与标准色块比较，读出照射强度。

4.4.1.3结果判定：

(1)30w新灯管，不低于90μW/cm²为合格。

(2)使用中的旧灯管不低于70μW/cm²为合格。

4.4.1.4注意事项：

（1）紫外线照射时应严格控制时间，否则测定结果不准确。

（2）指示卡为光敏材料制成，应避光保存。

4.4.2浓度试纸测定法

4.4.2.1 G-1型消毒剂浓度试纸

4.4.2.1.1使用范围:过氧乙酸、含氯消毒剂（如漂白粉、二氯异氰尿酸钠、次氯酸钠、氯化磷酸三钠等）、二氧化氯消毒剂等的现场测定。

4.4.2.1.2使用方法

(1）消毒剂溶液有效成分浓度在浓度试纸测定范围内时，取试纸浸于消毒液中，片刻取出，半分钟内在自然光下与标准色块比较，读出溶液所含有效成分含量。

(2）消毒剂溶液有效成分浓度高于浓度试纸测定范围内时，可用自来水先将消毒剂稀释，使其有效成分浓度在试纸测定范围内，再按上法进行测定。

(3）对固体消毒剂测定时，应先用自来水将消毒剂配制成溶液，并使其有效成分浓度在试纸测定范围内，再按上法进行测定并计算有效成分浓度。

4.4.2.1.3结果判定

(1)直接测定的消毒剂溶液，对应标准色块上所示浓度为该消毒剂溶液的有效成分浓度。

(2)固体消毒剂或需稀释的消毒剂，其有效成分浓度为比色所得值乘以稀释倍数即为该消毒剂的有效成分浓度。

4.4.2.1.4注意事项

(1)溶液有效成分>1000mg/L时准确性较差，浓度在20mg/L～500mg/L时，测定结果较

准确。

(2)试纸浸湿后时间超过1min，颜色逐渐消退，结果不准确。

(3)本法所测结果不精确。

(4)用后，剩余试纸应及时放回原塑料袋内包好，以免受到环境中其他药物的影响，影响

以后的测定。

4.4.2.2其他型号浓度试纸

各种浓度试纸应通过检测机构和有关部门的检测与认可。使用时可按照说明书进行操作。

4.4.3含氯消毒剂中有效氯的简易检测

4.4.3.1 漂白粉中有效氯的简易检测：称取0.5g漂白粉于10ml比色管中，加入清水至10ml，强烈振摇1 min，放置5 min，倾出上清液，用吸管吸出38滴于白瓷盘中。将此吸管洗净，吸蓝墨水滴加于吸出的漂白粉上清液上，边搅拌边滴加蓝墨水，直至出现稳定的蓝绿色为止。消耗蓝墨水的滴数即为该漂白粉中有效氯的百分含量。

4.4.3.2漂白粉精中有效氯的简易检测：方法与漂白粉中有效氯的简易检测(4.4.3.1)相同，只是取样品澄清液19滴，有效氯的百分含量为蓝墨水滴数的两倍。

4.4.4 水中余氯检验

取经消毒的水样用市售余氯比色器或余氯测定试剂盒测定，也可以用DPD比色法或邻联甲苯胺比色法。

4.5各种污染对象的常用消毒方法

4.5.1地面、墙壁、门窗：对细菌繁殖体和病毒的污染，用0.2%～0.5% 过氧乙酸溶液或500mg/L～1000mg/L二溴海因溶液或1000mg/L～2000mg/L有效氯含氯消毒剂溶液喷雾。泥土墙吸液量为150 ml/m²～300 ml/m²，水泥墙、木板墙、石灰墙为100 ml/m²。对上述各种墙壁的喷洒消毒剂溶液不宜超过其吸液量。地面消毒先由外向内喷雾一次，喷药量为200 ml/m²～300ml/m²，待室内消毒完毕后，再由内向外重复喷雾一次。以上消毒处理，作用时间应不少于60min。有芽胞污染时应用0.5%～1.0%过氧乙酸溶液或30000mg/L有效氯含氯消毒剂进行喷洒。喷洒量与繁殖体污染时相同，作用时间不少于120min。

4.5.2空气：房屋经密闭后，对细菌繁殖体和病毒的污染，每立方米用15% 过氧乙酸溶液7 ml（1 g/m³），对细菌芽胞的污染用20 ml（3 g/m³），放置瓷或玻璃器皿中加热蒸发，薰蒸2 h，即可开门窗通风。或以2% 过氧乙酸溶液（8ml/m³）气溶胶喷雾消毒，作用30min～60min。

4.5.3衣服、被褥：被细菌繁殖体或病毒污染时，耐热、耐湿的纺织品可煮沸消毒30min，或用流通蒸汽消毒30 min，或用250mg/L～500mg/L有效氯的含氯消毒剂浸泡30min；不耐热的毛衣、毛毯、被褥、化纤尼龙制品等，可采取过氧乙酸薰蒸消毒。薰蒸消毒时，将欲消毒衣物悬挂室内（勿堆集一处），密闭门窗，糊好缝隙，每立方米用15% 过氧乙酸7ml（1g/m³），放置瓷或玻璃容器中，加热薰蒸1h～2h。被细菌芽胞污染时，也可采用过氧乙酸薰蒸消毒。薰蒸消毒方法与被繁殖体污染时相同，用药量为每立方米15% 过氧乙酸20ml（3 g/m³）；或将被消毒物品置环氧乙烷消毒柜中，在温度为54℃，相对湿度为80%条件下，用环氧乙烷气体（800mg/L）消毒4h～6h；或用高压灭菌蒸汽进行消毒。

4.5.4病人排泄物和呕吐物：稀薄的排泄物或呕吐物，每1000 ml可加漂白粉50g或20000mg/L有效氯含氯消毒剂溶液2000ml，搅匀放置2h。无粪的尿液每1000ml加入干漂白粉5g或次氯酸钙1.5 g或10000mg/L有效氯含氯消毒剂溶液100 ml混匀放置2h。成形粪便不能用干漂白粉消毒，可用20% 漂白粉乳剂（含有效氯5%），或50000mg/L有效氯含氯消毒剂溶液2 份加于1份粪便中，混匀后，作用2h。

4.5.5餐（饮）具：首选煮沸消毒15 min～30 min，或流通蒸汽消毒30 min。也可用0.5% 过氧乙酸溶液或250mg/L～500mg/L二溴海因溶液或250mg/L～500 mg/L有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30min后，再用清水洗净。

4.5.6食物：瓜果、蔬菜类可用0.2%～0.5% 过氧乙酸溶液浸泡10 min，或用12mg/L臭氧水冲洗60min～90min。病人的剩余饭菜不可再食用，煮沸30min，或用20% 漂白粉乳剂、50000mg/L有效氯含氯消毒剂溶液浸泡消毒2 h后处理。也可焚烧处理。

4.5.7盛排泄物或呕吐物的容器：可用2% 漂白粉澄清液（含有效氯 5000 mg/L）、或5000mg/L有效氯含氯消毒剂溶液、或0.5% 过氧乙酸溶液浸泡30 min，浸泡时，消毒液要漫过容器。

4.5.8家用物品、家俱、玩具：可用0.2%～0.5% 过氧乙酸溶液或1000mg/L～2000mg/L有效氯含氯消毒剂进行浸泡、喷洒或擦洗消毒。布制玩具尽量作焚烧处理。

4.5.9纸张、书报：可采用过氧乙酸或环氧乙烷气体薰蒸 (消毒剂量和方法同4.5.3)，无应用价值的纸张、书报焚烧。

4.5.10手与皮肤：用0.5% 碘伏溶液（含有效碘5 000 mg/L）或0.5%氯己定醇溶液涂擦，作用1 min～3 min。也可用75%乙醇或0.1%苯扎溴铵溶液浸泡1 min～3min。必要时，用0.2% 过氧乙酸溶液浸泡，或用0.2% 过氧乙酸棉球、纱布块擦拭。

4.5.11病人尸体：对鼠疫、霍乱和炭疽病人的尸体用0.5% 过氧乙酸溶液浸湿的布单严密包裹，口、鼻、耳、肛门、阴道要用浸过0.5% 过氧乙酸的棉球堵塞后尽快火化。土葬时，应远离水源50 m以上，棺木应在距地面2m以下深埋，棺内尸体两侧及底部铺垫厚达75px～5 cm漂白粉，棺外底部铺垫厚75px～125px漂白粉。

4.5.12动物尸体：因鼠疫、炭疽、狂犬病等死亡的动物尸体，一经发现立即深埋或焚烧。并应向死亡动物周围(鼠为750px～1250px，大动物为2 m)喷撒漂白粉。

4.5.13运输工具：车、船内外表面和空间，可用0.5% 过氧乙酸溶液或10000mg/L有效氯含氯消毒剂溶液喷洒至表面湿润，作用60 min。密封空间，可用过氧乙酸溶液薰蒸消毒。对细菌繁殖体的污染，每立方米用15% 过氧乙酸7 ml（1g/m³），对细菌芽孢的污染用20ml (3g/m³)蒸发薰蒸消毒2h。对密闭空间还可用2%过氧乙酸进行气溶胶喷雾，用量为8ml/m³ ，作用60min。

4.5.14厕所：厕所的四壁和地面的消毒，方法同4.5.1。粪坑内的粪便可按粪便量的1/10加漂白粉，或加其他含氯消毒剂干粉或溶液(使有效氯作用浓度为20000mg/L)，搅匀作用12h～24h。

4.5.15垃圾：可燃物质尽量焚烧，也可喷洒10000 mg/L有效氯含氯消毒剂溶液，作用60 min以上。消毒后深埋。

4.5.16污水消毒

4.5.16.1疫点内的生活污水，应尽量集中在缸、桶中进行消毒。每10 L污水加入10000mg/L有效氯含氯消毒溶液10 ml，或加漂白粉4 g。混匀后作用1.5 h～2 h，余氯为4mg/L～6 mg/L时即可排放。

4.5.16.2对疫区内污染的生活污水，可使用含氯消毒剂进行消毒。消毒静止的污水水体时，应先测定污水的容积，而后按有效氯80mg/L～100 mg/L的量将消毒剂投入污水中。搅拌均匀，作用1h～1.5h。检查余氯在4mg/L～6mg/L时，即可排放。对流动污水的水体，应作分期截流。在截流后，测污水容量，再按消毒静止污水水体的方法和要求进行消毒与检测。符合要求后，放流，再引入并截流新来的污水，如此分期依次进行消毒处理。

4.6 疫区饮用水的消毒与管理   略

附录A   消毒试验用试剂和培养基配方（略）

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