年轻恒牙牙髓再生性治疗的研究进展

宋光泰，靳秋晨

武汉大学口腔医院儿童口腔科，湖北  武汉（430079)

【作者简介】宋光泰，男，1964年出生于湖北，1985年毕业于湖北医学院口腔系，获学士学位，1990年毕业于湖北医学院口腔系，获硕士学位，2005年毕业于武汉大学口腔医学院，获博士学位。现任武汉大学口腔医(学）院儿童口腔科主任，教授、主任医师，研究生导师。兼任中华口腔医学会儿童口腔医学专业委员会第三、四届副主任委员，第二、五届常务委员；武汉口腔医学会常务理事兼秘书长;亚洲儿童牙科学会(PDAA)理事(2008—2016);湖北省口腔医学会常务理事；国际儿童牙科协会(IAPD)会员。2003—2004年，加拿大多伦多大学牙学院、McMaster大学访问学者。1997—1999年，赴莱索托王国国家转诊医院(Queen E.Ⅱ)援外医疗。系统掌握口腔医学专业及相关学科知识，具有较高的理论水平和操作能力。作者特别擅长于儿童口腔疾病的诊断、治疗及预防，负责和参加了本科生、研究生等多层次教学工作，对PBL教学有较深研究。负责和参与十余项科研项目，发表论文30余篇，多次参加全国及国际性学术会议。

【摘要】个体患牙髓病或根尖周病后，年轻恒牙牙根的继续生长发育受阻，因此，如何保证患牙根尖的正常形成和继续生长发育对口腔医生而言极具挑战。近年来报道的牙髓再生治疗病例，其利用根管内残余牙髓组织、根尖周或牙周组织中干细胞的再生分化能力，在合适的条件诱导下再生出新的高度血管化并富含结缔组织的活髓，促使牙根继续生长发育，牙根长度增加、根管壁增厚、根尖孔缩窄闭合，而且临床检查和影像学辅助检查的结果均较理想，这具有划时代的意义。牙髓再生基于组织工程学，以达到用新生牙髓组织代替原有病变牙髓组织目的。其包括两种理念：一是牙髓血运重建，诱导根尖部干细胞迁移和分化，在患牙根管内新生出有活力的牙髓样组织，完成牙根继续生长发育；二是运用组织工程技术，将具有增殖分化潜能的干细胞和适宜的生物活性支架物质置入患牙根管内，在一定的生长因子诱导下，产生新的牙本质牙髓复合体(dentin-pulpcomplex,DPC)，实现牙髓再生。笔者就这两部分的研究进展作一阐述。

【关键词】年轻恒牙；牙髓再生；牙髓再血管化；组织工程；生长因子

【引用著录格式】宋光泰,靳秋晨.年轻恒牙牙髓再生性治疗的研究进展[J].口腔疾病防治，2016,24(12)：681­-687.

The research progress ofregenerative endodontic treatment for immature permanent teeth

SONGGuang-tai, JIN Qiu-chen

Departmentof Pediatrics Dentistry, School & Hospital of Stomatology, WuhanUniversity, Wuhan 430079, China

Correspondingauthor: SONG Guang-tai, Email: gtsong@whu.edu.cn, Tel:0086-27-87686262

【Abstract】 The pulpal orperiapical diseases of immature permanent teeth often lead to incomplete rootdevelop­ment. It is a challenge for us to figure out how to ensure thecontinuous growth of the teeth and the formation of roots.There are many cases about pulpregeneration reported recently. With the regeneration and differentiationability of stem cells, which exist in residual pulp tissue, periapical andperiodontal tissues, the regeneration of new vital pulp tis­sue was inducedunder proper conditions, which is highly vascularized and rich in connectivetissue, thus prompting continuous root growth and development, increasing rootlength, thickening root canal walls, and facilitating the coarcta­tion of theapical foramen. Besides, clinical and radiographic examinations showssuccessful results about the regenera­tive treatment, which is of milestonesignificance. The pulp regeneration treatment is designed to replace thepathologi­cal dental pulp tissue with new regenerated pulp tissue, based onbiological tissue engineering process. This process in­cludes two key parts:one is pulp revascularization, regenerating new vital pulp tissue in the rootcanal to achieve the continuous root growth and development; the other istissue engineering, new pulp dentin complex is regenerated by the stem cellsunder the induction of suitable biological active scaffolds and growth factors.This article reviews about the re­search progress and clinical characteristicsof aforementioned two key parts.

【Keywords】 Immature permanenttooth; Pulp regeneration; Pulp revascularization; Tissue engineering; Growthfactor

【收稿日期】2016-02-16；【修回日期】2016-08-01

【基金项目】湖北省自然科学基金(2015CFB258)

【通讯作者】宋光泰，教授，博士，E-mail ：gtsong@whu.edu.cn

年轻恒牙是指萌出后没有到达牙合平面、形态和结构没有完全发育成熟、根尖孔未完全闭合的恒牙。年轻恒牙从牙齿开始萌出直至牙根达到应有的长度需2~3年，而实现根尖孔缩窄一般需要3~5年。年轻恒牙髓腔中的牙髓组织结构与成熟恒牙相比较为疏松，其中含较多细胞成分，但相对缺乏纤维成分，且富含血管，具有旺盛的生命力，且由于根尖孔粗大敞开，若牙髓组织发生炎症，感染极容易在牙髓、根尖周组织之间扩散。而此期间常因龋病、外伤等多种原因致使牙髓感染坏死，牙根发育终止，导致根尖孔呈开放状态。对于此类患牙，传统的治疗方法有两种_：根尖手术后倒充填治疗和根尖诱导成形术后行根管治疗。倒充填治疗只能封闭敞开的根尖孔，不能增加牙根长度，亦无法使牙根继续生长发育，导致冠根比大，不利于患牙远期保存；根尖诱导成形术虽能一定程度诱导根尖闭合，形成一种人丁根尖屏障，但疗程较长、复诊次数多、根管系统有再感染的可能^[1]，此外形成的牙根形态与正常牙根不同，牙根质地脆弱易致牙颈部折断^[2]。此外，完善的根管治疗虽能延长患牙在口腔内保存时间，但与健康牙齿相比更易脱落。近些年来，随着分子生物学、再生医学、组织丁程学等众多相关学科的迅猛发展，逐渐产生“再生性牙髓治疗（RET)”的理念，即以具有生物活性的新生牙髓组织代替病变的牙本质牙髓复合体，以恢复牙体组织的生命和活力^[3]。早在1971年，Nygaard-Ostby等^[4]学者首次观察到摘除牙髓组织后的牙齿在根尖血液呈充盈状态时的反应，由于当时技术、材料和器械等方面的限制，该尝试虽未获得成功，但被认为是牙髓再生的先驱。牙髓再生的目标为：①在牙髓腔内生成一种富含血管、神经及成牙本质样细胞的类牙髓样的组织，尤其是形成新生的牙本质牙髓复合体，与牙本质通过成牙本质细胞紧密连接，以引导牙本质的规律性沉积;②在根尖端实现牙根继续生长伸长，形成根尖封闭并通过缩窄的根尖孔与根尖周组织相连；③含有神经组织和新生血管，即“功能性的牙髓再生”。因此，牙髓再生是在组织丁程的基础上，实现牙髓再血管化与功能性再生，包括成牙本质细胞和（或）神经纤维再生，如果没有组织丁程或牙髓再血管化，牙髓再生将无法实现。但是，组织丁程技术应用于临床牙髓再生治疗，还需要更深人的探索，笔者就这两部分的研究进展作一综述。

1  牙髓再血管化

若要实现牙髓再生，为牙髓提供一个适宜生存的环境而保证血氧供应和抗感染能力是前提，以形成牙髓组织的血运重建，即牙髓再血管化。牙髓再生的研究也得益于之前的牙髓再血管化研究，早在1966年，Rule等^[5]报告了1例年轻下颌恒前磨牙牙髓坏死的病例，该患牙根管经过机械预备和多联抗生素根管消毒后进行诱导出血，观察到牙根继续发育、根尖孔闭合。Iwaya等^[6]也报告了1例13岁儿童的年轻下颌前磨牙外伤、牙髓坏死后，实现牙髓再血管化、根尖孔闭合和根管壁增厚的病例。Banchs等^[7]首先提出了牙髓再血管化(revascularization)”的概念，目的是代替年轻恒牙中坏死或感染的病变牙髓组织，再生新的血管、神经等组织，由此牙根得以进一步生长发育。目前，牙髓再血管化治疗已趋常态化，美国牙髓病协会和欧洲牙髓病协会已出版规范的临床指南。

牙髓再血管化的治疗核心在于严格控制根管系统感染、给予组织新生的基质(如自体血凝块，或富血小板血浆、浓缩生长因子等植人），同时在其冠方严密充填和封闭，以此保证适宜的生物学环境利于血管再生的实现。成功实现牙髓再血管化的前提是:根尖孔直径>1mm。其临床成功取决于三个重要方面_:根管系统的彻底消毒、支架性基质的存在、严密的冠方封闭^[12]。

1.1根管系统的彻底消毒

1.1.1无机械预备  机械预备不仅使薄弱的根管牙本质壁更脆弱，而且会破坏存在于根尖区的干细胞。根尖区在成牙本质过程中会释放部分生长因子，成牙本质细胞和Hertwig’s上皮根鞘细胞是实现正常牙根发育所必需的细胞，可分化产生次级牙本质细胞，该细胞对根管内壁上牙本质的规律性沉积有诱导作用，实现根管壁增厚及牙根长度的增加，它们大量存在于年轻恒牙根尖区域，能够抵抗一定的炎症感染，机械预备的同时也会清除这些生长因子和再生过程中必需的其他细胞 ^[13]。Cehreli等^[14]的研究表明，尽管相关病例少，不具有统计学意义，但仍发现一些未经根管机械预备的患牙在术后可以重获活力。因此，大多数学者赞同在牙髓再血管化的治疗过程中无需机械预备根管系统，以维持干细胞活性，避免削弱过于薄弱的根管壁。

1.1.2冲洗  冲洗在初步根管消毒中发挥重要作用，冲洗剂应具有最大的杀菌抑菌功效，同时对干细胞和成纤维细胞有最小的细胞毒性，以维持其活力及增殖、分化能力。细菌侵人到根管系统，将形成一层细菌性生物膜，黏附在根管内壁并堵塞牙本质小管。为达到最佳的根管消毒效果，必须彻底清除细菌生物膜，如使用“根管刷”(root canal brush)等工具，有效清除细菌生物膜，同时不至于破坏牙体硬组织，然而使用此类丁具存在非生物相容性物质(刷毛）残留于根管内的风险。冲洗过程中使用超声振荡可以产生空穴效应、声流效应以及热效应，加快冲洗剂与细菌性生物膜的化学反应以达到强化对根管系统内各种细菌及微生物的杀灭或抑制的效果，但在超声冲洗振荡过程中必须注意尽量不使超声丁作尖直接与根管内壁接触。

目前临床应用的冲洗剂种类繁多_：①过氧化氢，人体组织中含有过氧化氢酶，接触到过氧化氢时能够释放出新生氧，其发泡作用能将根管渗出及坏死组织清除，同时具有止血功能，但过氧化氢的组织溶解性能较差、作用时间短暂、有发生疼痛和术后肿胀等不良反应的可能。②次氯酸钠，次氯酸钠是目前临床使用最多的一种根管冲洗剂，能够较强地溶解牙髓坏死组织和根管玷污层中的有机物，推荐的使用浓度从0.50%-5.25%不等，细胞毒性与浓度成正相关，2.5%的浓度兼具高效的抑菌杀菌作用和较低细胞毒性，为临床最适合选用的浓度^[15]。美国牙髓病协会推荐的浓度是1.5%，每根管20mL^[16]。此外研究发现若次氯酸钠冲洗剂的温度升高，其瞬时溶解组织的能力、冲洗的效果也将同步加强。③氯己定，具有广谱抗菌的效果，与次氯酸钠的抗菌效果类似，尤其能较强地抑制革兰阳性菌、念珠菌感染，且一般对氯己定不容易产生耐药菌株。氯己定没有组织溶解作用，亦可引起牙体着色，因此在氯己定冲洗间交替使用生理盐水冲洗，清除产生的色素。④乙二胺四乙酸（EDTA)，EDTA是一种强效螯合剂，在临床应用中经常与其他冲洗剂（如次氯酸钠溶液)联合使用。通过与细菌生长所必需的金属离子螯合而具有一定抗微生物性能。17%的EDTA冲洗剂在临床丁作中常用作去除牙本质中的有机物和无机物，以及牙髓组织中的部分无机物成分，亦可清除牙本质玷污层并开放牙本质小管，从而提高冲洗剂及根管内封药的效果^[17-18]。Ring等^[19]研究发现EDTA与2%氯己定联合使用后导致干细胞无法存活，还会形成氯盐沉积在根管内，这些沉积物有细胞毒性且会阻碍干细胞在根管壁上的附着。建议在使用EDTA冲洗后用生理盐水冲洗以减少沉淀物沉积，同时可以清除组织残片和冲洗剂的残留。

1.2支架性基质

1.2.1自体血凝块   刺激根尖区出血，可在根管内形成支架样结构的血凝块，支持根尖周细胞及间充质干细胞粘附、迁移、分化。血凝块中富含生长因子，能够对成纤维细胞、成骨细胞、成牙本质细胞等多种重要细胞的增殖和分化过程产生刺激作用，在组织再生中起到了关键作用。在刺激根尖出血时，尽量不使用含血管收缩剂的麻醉剂，以保证根管内有充足的血量^[21]。目前，自体血凝块作为牙髓再血管化的基质而在临床中最为常用。

1.2.2   富血小板血浆（PRP)    PRP是将自体的全血通过离心所得到的一种血小板浓缩物，其中富含大量生长因子，可以促进形成胶原蛋白。动物实验显示，对比血凝块与PRP在牙髓再生中的作用，发现无论是新生牙髓或者根管内硬组织的生成，两者差异均无统计学意义^[22]。临床应用中出现根尖部血管破坏，刺激根尖出血时未形成血凝块，或血凝块形成质量不佳时，推荐使用PRP。Torabinejad等^[23]报道了1例上颌年轻恒前磨牙外伤脱位牙髓坏死再植后，使用PRP实现牙髓再血管化的病例。5~6个月后对患者随访的影像学检查证实，有牙根的继续生长发育和根管壁厚度的增加，同时牙髓活力检测到阳性反应。

然而PRP的制备过程复杂繁琐，成功率不高，需要经过二次离心，而且要加人牛凝血酶、氯化钙等额外的添加剂。另外其安全性以及是否会引起感染等问题仍不确定，确切作用机制及PRP能发挥作用的剂量尚无确切依据，这些问题严重限制了其在研究及临床中的应用^[24]。

1.2.3    富血小板纤维蛋白(PRF)     PRF是可应用到牙髓血管再生过程中的潜在支架材料^[25]，富含血管内皮生长因子（VEGF)、血小板源性生长因子（PDGF)、转化生长因子等生长因子。能够将生长因子缓释，增强多种细胞的增殖、分化，促进血管生成，同时PRF也具有抗炎和抗感染的功能，此外亦是能将矿化物三氧化物聚合体（MTA)的作用最大化的理想基质物质。

1.2.4   浓缩生长因子（CGF)      自体来源的GCF，是第2代血浆提取产物，有完全独特属性的一种愈合型的生物性材料，最早由Sacco在2006年开发研制而来。CGF采用Medifuge离心机精准变速离心制成，与PRP的制备相比，过程更为简单、成功率较高，而且由于不必添加额外的试剂，不会引起感染。此外，经过精准变速离心后，纤维蛋白原发生聚合作用，内部的纤维交织形成三维纤维蛋白聚合网络。该三维网状结构柔软富有弹性，有一定的孔径与渗透性，能够很好地滞纳血小板和其他循环分子。

制取CGF凝胶时，这种独特的预设变速离心法将激活血小板，使血小板颗粒释放多种生长因子，这些因子具有促进细胞增殖分化、合成基质物质和生成血管的作用。而CGF独特的三维网格状支架结构又能支持引导经生长因子诱导产生的新生组织的生长。目前经过科学证实的浓缩生长因子中包含的生长因子有：转移生长因子(TGF)、PDGF、类膜岛素生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、VEGF和成纤维细胞生长因子(FGF)等。这些因子均可单独或和其他因子联合参与或促进血管、神经、矿化组织的形成，以及牙髓、牙周组织再生的过程^[26]。目前有学者已将CGF应用于牙髓血管再生，收到良好的临床效果，但长期效果仍需进一步观察。

1.3冠方封闭

研究证实，为避免细菌从冠方侵人根管系统造成根管内再感染，应进行严密的冠方充填封闭，这也是成功实现牙髓血管再生的基本条件之一⑴。根据多数学者的建议，可在血凝块的上方双层材料封闭，例如使用MTA和树脂粘接进行冠方充填^[27-33]。也有一些学者推荐三层材料封闭，亦即在MTA和复合树脂之间加人一层玻璃离子作为第二层封闭材料，以使冠方的封闭更为严密。

在牙髓血管再生术中MTA常常和牙髓组织、根管内血凝块或再生组织等直接接触，具备良好的生物相容性、封闭性、稳定性和较强的抑菌性，同时具有良好的亲水性和其独特的硬固性能。然而不足之处是临床操作中固化时间长、花费高、而且易使牙体组织变色。Gelman等^[35]建议改用白色MTA代替灰色MTA，避免术后牙冠颜色的改变。Khetarpal等^[36]建议使用桂酸三钙(Biodentine)代替MTA放置于血凝块的上方。Biodentine是一种具有良好的生物活性和封闭特性的牙本质代替物，其达到硬固所需的时间与MTA相比更短，临床操作过程更简便，避免了MTA引起牙冠颜色改变的可能。

2  组织工程技术

组织工程被定义为应用组织工程学和生命科学来构建恢复、维持、提高组织功能的生物替代品的跨学科领域^[37]。此原理应用于口腔医学研究领域，即牙组织工程。牙组织工程的三要素包括_：牙源性干细胞、支架、生长因子。针对牙髓再生的组织工程，需要牙髓干细胞及其相应的支架与生长因子协同作用。

2.1   牙源性干细胞

2000年，Gronthos等^[38]自牙髓中分离出牙髓干细胞，为组织工程学在口腔领域的研究奠定了基础。自体牙髓干细胞是牙髓再生过程中最具潜力的一种干细胞，引发免疫反应的可能性较小。与非牙髓干细胞（如骨髓基质干细胞）相比，它们表现出更显著的分化潜能(形成典型的牙齿样组织，兼具成釉及成牙本质功能）^[39]。

到目前为止，已经分离和描述的牙源性干细胞有以下4种：牙髓干细胞（DPSCs)、脱落乳牙干细胞、根尖牙乳头干细胞(SCAP)、牙周膜干细胞(PDLSCs)，这几种干细胞具有增殖和多向分化的能力，而且较易获得，易于通过注射器注射(干细胞注射疗法）。但使用该技术，细胞存活率较低，可能会迁移至体内不同部位、导致异常形式的矿化^[41]，为解决此问题，需要将干细胞与支架材料相结合使用。

2.2   支架

支架可为组织再生中的干细胞提供一个相对稳固的三维结构以保证其正常生长、发育和分化。选择支架材料，主要考虑以下几方面：良好的组织相容性，具有多孔性结构以容纳细胞^42]，同时可降解，能够逐渐被再生组织替代分解而无需通过手术的方式取出，且支架材料的分解速度最好与组织新生的速度保持一致。支架材料还应具备合适的孔径率及孔径，以便于细胞及养分的进人、扩散和代谢废物的排出^[43]。目前美国食品药品管理局（FDA)已经批准大多数的组织工程所使用的生物材料作为支架，包括天然支架或人工合成支架，天然支架包括胶原、牙本质、纤维蛋白、蚕丝、藻酸盐等，人工合成支架包括各种聚合物，例如聚乳酸(PLA)、聚轻基乙酸（PGA)等。对牙髓组织再生而言，聚合物水凝胶⁴⁴中含水量高、柔软具有弹性、与水及生物流体表面张力低，水凝胶与活组织具有相似的物理性质，能够无创性地直接被注射进根管系统内部。另一种可注射支架是卩磷酸三钙^45]。此外，经过处理的牙本质基质也可为牙组织再生提供合适的环境^[46]，蚕丝支架可在牙釉质、牙本质形成过程中促进矿化，其支架孔隙能够引导组织矿化^[47]。另外还有一种釉基质蛋白，主要成分是釉原蛋白，在生物矿化和硬组织形成中意义重大，也是一种潜在的支架材料^[48]。

2.3    生长因子

生长因子是一类与受体结合、诱导细胞增殖和分化的蛋白质。很多生长因子具有多效性，能够刺激各种类型细胞诱导细胞分裂，而另一些生长因子则更有细胞特异性^[49]。生长因子在牙髓一牙本质再生过程中发挥了重要的信号传导作用，其中重要的生长因子包括_：转移生长因子（TGF)、骨形成蛋白(BMP)。

成牙本质细胞分泌的TGF-P1和TGF-P3生长因子，在成牙本质细胞分化的信号传导和刺激牙本质基质分泌的过程中具有特殊意义，分布在牙本质基质中，通过与牙本质基质的其他成分发生相互作用而保持活性。BMP-2、BMP-4和BMP-7被证实能够在干细胞分化为成牙本质细胞过程中起诱导促进作用，促使牙本质形成。一些天然状态下存在的物质可发挥生长因子的作用，釉基质衍生物作用于牙髓牙本质复合体时能够释放出具有生物活性的分子，同样可诱导牙本质的形成。生长因子可通过多种方式导人_：直接加人生长因子成品、内源性释放等，生长因子在体内半衰期较短，它们需要在一个更长的时间段内保持活性，因此，另一种方式即运输能够编码生长因子的基因而不是生长因子本身，这就是基因疗法。

目前，组织工程牙髓再生研究仍处于临床前动物实验阶段。研究常用的干细胞有DPSCs、脱落乳牙干细胞和SCAP。有实验证明在体外扩增培养DPSC、脱落乳牙干细胞和SCAP，通过支架分别植人大鼠皮下和猪的牙槽窝中，可形成牙本质牙髓复合体^[5"^51]。Huang等^[52在动物实验中，将D，L-丙交酯和乙交酯多聚物生物支架和DPSC和SCAP细胞混合物放到预先处理的牙根管中并移植到大鼠皮下组织。3-4个月后取出植人物，经组织学分析发现有高质量的类牙髓组织形成，但其细胞结构有异于天然牙髓中成牙本质细胞，且新生组织中未见正常的神经结构。

除上述体外扩增培养干细胞之外，还可采用细胞归巢的方法实现牙组织工程学上的牙髓再生。细胞归巢即将含有各种信号分子的生物性支架植人根管，利用内源性干细胞诱导迁移，稳定于再生部位，刺激其增殖、分化形成新生组织。细胞归巢利用的内源性细胞，生物相容性良好，克服并降低了体外干细胞扩增培养和移植的风险，但应注意选择恰当的生长因子。该类研究目前也仍处在动物研究的临床前期阶段，且成果并不稳定，暂时也无临床证据证明其治疗方案的有效性，尚需要进一步的研究。

3  小结

美国牙髓病协会提出再生性牙髓病学将引领未来口腔医学的发展方向。多例年轻恒牙牙髓坏死牙髓再血管化的临床病例报告结果显示，伴有牙根继续发育和牙本质壁增厚，患牙活力测试有一定的反应。与传统方法相比，牙髓再生治疗在促进根尖周损伤的愈合、促进牙根发育及最大程度地保存患牙、提高存活率方面有较大的优势。然而，至今牙髓组织再生的组织学机制尚未有定论，缺乏长期的随访观察及预后评估资料，严重制约该技术在临床上的推广，牙髓再生的基础理论与临床应用仍需进一步的科学研究。

来源:口腔疾病防止杂志