杨丕山

【述评】TNF-α/NF-κB信号通路对牙周炎发展和牙周再生的影响及其干预

专家介绍：杨丕山，教授，主任医师，博士研究生导师。2015年受聘为山东大学口腔医院知名专家,享受国务院津贴。现任中华口腔医学会牙周病学专业委员会副主任委员，中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会常务委员，山东省口腔医学会牙周病学专委会主任委员。主要从事牙周再生基础研究和牙周病临床工作。擅长牙周、牙体疑难疾病的诊断和治疗，复杂牙周疾病的多学科治疗设计、综合治疗，重度牙周炎的基础治疗、再生手术治疗、种植修复治疗和维护。作为课题负责人，先后主持国家自然科学基金项目5项，省部级课题8项。在国内外期刊发表论文100余篇，其中SCI收录论文50余篇。获省科技进步二、三等奖各1项，国家发明专利1项。

［摘要］ 牙周病是以菌斑微生物为始动因子的感染性疾病，菌斑微生物可刺激宿主细胞产生炎性和免疫因子，其中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）作为一个多向性的先导感染细胞因子,在牙周炎的发生、发展过程中起重要作用，同时也是牙周再生的重要影响因素。龈沟液中TNF-α水平的变化已经被用来作为牙周炎治疗的效果以及判断预后的重要指标，越来越多的研究开始关注以TNF-α作用过程为靶点探讨牙周炎发展控制和牙周再生促进的有效方法。本文就TNF-α/ NF-κB信号通路对牙周病发展和牙周再生的影响及其干预治疗现状作一综述，以期为牙周病治疗提供新思路。

［关键词］  牙周炎；炎性因子；肿瘤坏死因子-α；抗炎治疗；牙周再生

    牙周炎是以牙周软硬组织的炎症和破坏为特征的发病率较高的疾病，严重影响口腔健康，并且可能影响其他系统性疾病。现代观点认为，菌斑微生物及宿主对菌斑微生物的免疫应答反应是牙周炎发病的两个关键因素。菌斑微生物是始动因素，宿主在应对微生物感染时所发生的免疫反应过程中产生的酶、细胞因子和炎症介质等则导致牙周支持组织破坏。因此，越来越多的研究者认为抗炎治疗同抗微生物治疗在牙周病治疗中同等重要［1-2］。牙周病的常规治疗主要是通过机械的方法去除菌斑微生物，能在一定程度上减轻炎症反应，降低炎症因子的水平。然而，深牙周袋内由于菌斑生物膜的存在，仍处于慢性炎症状态。即使较低浓度的致炎因子，长期刺激下仍会影响牙周治疗效果，特别是再生效果［3］。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α）是一种重要的炎性因子，可通过介导其它炎症介质的产生、促进破骨细胞的形成和增强破骨细胞的活性等，在牙周组织破坏中担任重要角色。同时，TNF-α也是牙周再生的重要影响因素。因此，了解TNF-α在牙周病发病和牙周再生中的作用及可能机制，进而以TNF-α为靶点进行相应的治疗，有望成为牙周病辅助治疗的重要策略。

1、TNF-α概述

    TNF-α是一种细胞信号蛋白（细胞因子），参与各系统的炎症反应，也是急性期反应的主要细胞因子之一。它主要由单核-巨噬细胞受到激活后产生［4］，菌斑微生物的脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）是诱导其产生的较强刺激剂。另外γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等对单核/巨噬细胞产生TNF-α有刺激作用，而前列腺素E（prostaglandin E，PGE）则有抑制作用。T淋巴细胞、T细胞杂交瘤、T淋巴样细胞系、NK细胞等在佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)刺激下也可分泌TNF-α。此外，中性粒细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated killer cell，LAK）、星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞亦可产生TNF-α。TNF-α可促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，提高中性粒细胞的吞噬能力，从而刺激机体局部炎症反应。TNF-α预先与内皮细胞培养可使其增加主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类抗原、细胞间粘附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达及白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、GM-CSF和IL-8的分泌；TNF-α还可刺激单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1。因此，TNF-α是一个多向性的先导感染细胞因子，可以通过激活下游的信号通路调节免疫反应、细胞凋亡、炎症以及肿瘤等病理过程，从而在多种疾病的发生发展中担任重要角色［5］。

    TNF-α具有两个不同的受体，即TNF受体-1（TNF receptor-1, TNFR1)和TNF受体-2(TNF receptor-2, TNFR2)。TNFR1在人体所有组织中均有表达，是TNF-α主要的信号受体，而TNFR2主要在免疫细胞或造血细胞中表达［6］。目前主要的观点认为，TNFR1介导了核因子（nuclear factor-κB, NF-κB）信号通路的激活和成骨分化的抑制［7］，而TNFR2激活对成骨分化可能起促进作用［8］。

2、TNF-α促进牙周组织破坏的作用及可能机制

2.1 TNF-α在牙周病发病中的作用

    牙周病是细菌感染性疾病，没有细菌就没有牙周炎。口腔内致病菌产生的脂多糖（lipopolysaccha-ride, LPS)刺激巨噬细胞产生一些前炎症因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α［9-10］，这些因子可相互作用，共同参与牙周组织破坏过程。其中TNF-α被认为是牙周组织炎性微环境中重要的内源性促炎因子。研究表明，TNF-α参与了大鼠的破骨细胞生成，重组TNF-α会加重老鼠牙周炎的发展破坏［11］。Di等［12］研究表明，注射用依那西普（etanercept，Enbrel）作为一种TNF-α的拮抗剂，可显著抑制大鼠牙周炎的发展。近年来，TNF-α基因多态性与牙周炎易感性的关系更受到关注，并显示两者之间具有相关性［13-14］。有些研究表明非手术牙周治疗后，龈沟液中炎症因子水平降低，因此推测炎症因子如IL-1、TNF-α可能作为评价牙周病治疗效果的生物学标志因子［15-16］。另有研究认为，可根据龈沟液中TNF-α的含量来判断牙周疾病的严重程度或是否处于活动期［17］。亦有学者认为TNF-α也是判断种植体周围疾病状态的重要炎症因子之一［18］。

2.2 作用机制

2.2.1  TNF-α促进牙周组织的破坏  目前研究认为TNF-α发挥促进牙周组织破坏的作用机制与NF-κB途径密切相关。TNF-α可以诱导成骨细胞／基质细胞、牙周原代细胞、T细胞、牙周膜细胞等表达核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，通过结合核因子-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK），促进破骨细胞生成和增强破骨细胞活性进而促进牙槽骨吸收［19］。Brunetti等［20］研究认为T淋巴细胞可通过RANKL和TNF-α的过表达促进牙周炎时的破骨反应。另外，TNF-α还可促进基质金属蛋白酶分泌，从而加速胶原纤维分解破坏和基质细胞凋亡，抑制牙周组织的修复再生等［21-22］。

2.2.2  TNF-α对牙周组织再生的影响及可能的机制  炎症初期的炎性因子是机体对损伤因素刺激所产生的最常见的防御性反应。然而，一旦这种刺激过强或时间过久，除导致牙槽骨丧失外，亦可对间充质干细胞的增殖和成骨分化产生抑制作用。研究表明，牙周炎患牙来源的牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）的成骨能力较牙周健康来源者显著降低［23-24］。许多炎性介质，如IL-1、IL-6、IL-11、IL-17和TNF-α等在干细胞成骨过程中起抑制作用。其中，TNF-α被认为是牙周炎炎症反应的主控调节者［25］，可通过激活多个信号通路而抑制PDLSCs成骨分化。Tan等［26］研究表明，TNF-α可通过激活蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase, PERK)信号通路而抑制PDLSCs成骨分化。Kong等［24］研究显示，TNF-α通过糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)抑制PDLSCs成骨分化，即TNF-α介导的成骨分化抑制与Wnt信号通路有关。此外，TNF-α还可通过激活NF-κB信号通路，进而抑制EphB4信号通路和成骨前体细胞成骨分化［27］或加速成骨细胞凋亡，抑制骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）移植后的骨再生［28］。除抑制PDLSCs外，TNF-α可抑制多种其他间充质干细胞的成骨分化：如BMSCs［29］、牙髓干细胞［30-31］以及脂肪干细胞［32］等。Liu等研究发现，多种炎性因子中仅TNF-α能促进BMSCs的凋亡［28］。然而，亦有研究表明，低剂量短期的TNF-α处理可促进BMSCs成骨分化，而长期慢性的炎性刺激，无论浓度高低，均可对BMSCs成骨分化产生抑制作用［3］。高剂量TNF-α对BMSCs成骨分化的抑制作用除了与核心结合因子α1（runt-related transcription factor 2, Runx2）的表达抑制有关外，还与Runx2对其下游骨涎蛋白启动子的激活被抑制有关［33］。

3、与TNF-α作用有关的潜在治疗方法在牙周炎治疗中的应用

3.1 抗TNF-α治疗对炎性骨吸收的抑制作用

    鉴于TNF-α对骨吸收的促进及对MSCs成骨分化和骨再生的抑制作用，针对TNF-α的拮抗治疗对炎性骨吸收应该有抑制作用，对炎性环境下的骨再生应该有间接促进作用。此方面的研究越来越多，并且取得了一定疗效。Oates等在实验性牙周炎中，使用TNF-α的拮抗剂可使骨丧失减少50％［22］。抗TNF-α抗体，如依那西普(etanercept, Enbrel)、英夫利昔单抗(infliximab, Remicade)和阿达木单抗(adalimumab, Humira)已被证明具有强有力的抗炎治疗作用，常被用于类风湿性关节炎和自身免疫病的治疗。另外这些抗TNF-α治疗同时能使牙周临床指标得以改善［34-35］。Infliximab亦被证实能减少大鼠牙周炎模型的牙槽骨吸收［36］。进一步的观察发现，这些抗TNF-α抗体治疗能间接促进炎性环境下的骨再生［37-38］。抗TNF-α治疗能提高糖尿病大鼠的糖耐受水平，从而降低对大鼠牙周组织的破坏［39］。

3.2 NF-κB信号抑制剂对炎性骨吸收的抑制及对骨再生的促进

    NF-κB信号激活是TNF-α诱导破骨细胞形成和抑制成骨细胞分化的主要机制，那么，NF-κB信号抑制剂有望能发挥对炎性骨吸收的抑制及对骨再生的促进之双重作用。胶霉毒素是多种真菌的代谢产物，具有抗菌、抗病毒和免疫抑制等生物学活性，还可作为NF-κB信号抑制剂。已有研究表明，胶霉毒素既能阻断TNF-α诱导的成骨分化的抑制，又能直接促进骨形成蛋白-2（bone morphogenic protein-2, BMP-2）诱导的骨再生［40］。龙胆紫是一种传统的抗菌消毒剂，但近年来的研究发现，龙胆紫还具有NF-κB信号抑制剂样的作用［41］，除了能直接促进成骨前体细胞的成骨分化和矿化，还能逆转TNF-α对成骨前体细胞成骨分化和矿化的抑制，同时能抑制破骨细胞的激活。其他某些自然化合物，如类黄酮［42］、维生素K2［43］可能有类似的作用。然而，这些药物在临床中的应用潜能还有待进一步研究。

3.3 TNF-α受体结合剂对炎性骨吸收的抑制及对骨再生的促进作用

    TNF-α具有TNFR1和TNFR2两个受体，而TNF-α抑制成骨的功能主要通过TNFR1介导［7］。因此， TNFR1结合剂可竞争性拮抗TNF-α的成骨抑制作用。

    多功能生长因子颗粒蛋白前体（progranulin，PGRN）是一种自分泌生长因子，高表达于上皮细胞、免疫细胞、神经元、软骨细胞和肿瘤细胞，在早期的胚胎发生、创伤愈合、炎症、机体防御、软骨发育等过程中起重要作用。PGRN可以与TNFR1和TNFR2结合，且与TNF-α相比，PGRN与TNF的受体，特别是TNFR2具有更高的亲和性，因而能阻断TNF-α与其受体的结合。PGRN具有三个与骨代谢和骨再生有关的作用：（1）拮抗TNF-α的致炎作用：PGRN对胶原诱导的鼠关节炎和TNF转基因鼠的自发性关节炎有抑制作用。在PGRN敲除鼠，软骨降解和骨关节炎进展加速［6,44］；在TNF-α转基因鼠，PGRN能阻断TNF-α诱导的破骨细胞分化［8］。（2）拮抗TNF-α介导的成骨或成软骨抑制作用：Zhao等［44］从骨关节炎患者分离培养软骨标本，TNF-α显著促进其粘蛋白的丧失，能诱导软骨细胞产生诱导型一氧化氮合酶（iNOS），而PGRN能逆转TNF-α的这些效应 。Wang等［45］研究了工程蛋白Atsttrin（由PGRN衍生而来的“最小化”TNFRs结合蛋白）体内外的成骨效应，发现TNF-α能抑制BMP-2诱导的体外成骨分化，而Atsttrin能逆转这一效应；3D打印的Atsttrin-Alg/nHAp支架能减少动物颅骨缺损内TNF-α阳性细胞的数量，同时促进骨再生；(3）直接促进成骨分化及骨缺损愈合，并参与BMP-2诱导的骨再生：Zhao等［8］表明，PGRN缺陷鼠骨缺损的再生能力比野生鼠差，而重组PGRN能显著促进野生鼠骨缺损的再生。PGRN介导的骨形成依赖于TNFR2而并非TNFR1，在TNFR2敲除小鼠中 PGRN丧失其促进骨再生的作用。作为BMP-2的下游信号，PGRN在BMP-2的促成骨分化过程中起关键作用，而其本身的下游信号是细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）1/2磷酸化和Runx2表达。PGRN 亦能通过激活ERK1/2信号通路增强软骨细胞的合成代谢，且该作用与TNFR2有关［45-46］。

    以上研究表明，PGRN既可以阻断TNF-α介导的破骨活性增强和成骨抑制效应，又能直接刺激成骨。更有意义的是，PGRN显示的TNF-α受体阻断作用比传统的抗TNF-α治疗(与TNF-α结合，而不是与其受体结合)更有优势［47］。PGRN这些综合作用提示其在TNF-α主控的慢性炎症性疾病的治疗和炎性环境下的骨再生方面可能具有独特的作用，有望用于牙周炎的抗炎和再生治疗。

    牙周病从本质上讲是由细菌引起的炎症和免疫反应造成骨改建内稳态破坏的结果。炎性介质，特别是TNF-α介导的破骨活性增强、MSCs和成骨细胞成骨活性抑制等可能是牙周炎症和牙槽骨丧失的主要机制，亦是影响牙周再生的重要因素。因此，针对TNF-α作用环节的拮抗治疗在牙周病的治疗（包括牙周再生治疗）中可能会有重要价值。能阻断NF-κB信号激活的自然化合物和能与TNF-α受体结合的拮抗剂有望成为牙周病抗炎治疗和炎性环境下的牙周再生治疗的新方向。随着Atsttrin的成功研制及进一步上市，基于PGRN的TNF-α拮抗治疗将具有良好的应用前景，有望成为牙周再生的重要治疗剂。 

文章来源：《口腔医学》2019年，39卷1期：1-5.