转：姚军 中华口腔医学杂志

作者：姚军，张琰君，张佳丽，杨秀娟

作者单位：350002 福州，福建医科大学附属口腔医院儿童牙科

通信作者：姚军，Email：dentyao@163.com，电话：0591-83755232

基金项目：福建省医学创新课题（2012-CX-27）

本文发表于《中华口腔医学杂志》2015，50（7）：408-412

DOI:10.3760/cma.j.issn.1002-0098.2015.07.006

配方奶粉是供给婴儿生长与发育所需营养的人工食品，可作为母乳的替代品。目前，婴幼儿配方奶粉已被公认为是适合婴幼儿的人工喂养营养品。根据婴幼儿配方食品国家标准（GB10765?2010）的规定，配方奶粉的碳水化合物中乳糖含量≥90%。6岁以下低龄儿童患龋主要由于不良喂养习惯和（或）延长的母乳或奶瓶喂养，其中不良喂养习惯包括：含奶瓶入睡、喂夜奶、延长母乳或奶瓶喂养时间、过多饮用含糖饮料等[1]。由此可见配方奶是低龄儿童患龋的主要危险因素之一。

赤藓糖醇（erythritol）是一种新型糖醇类甜味剂，近年研究发现其还有防龋及抑制细菌的作用[2?9]。文献报道主要集中研究赤藓糖醇对链球菌属及牙龈卟啉单胞菌的影响，赤藓糖醇对口腔中主要致龋菌之一的乳杆菌生长、产酸是否有影响尚少见报道。乳杆菌在流行病学中被称为“龋标志菌”[10]。

本实验采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析和比较乳杆菌的代表菌——嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，La）对不同浓度赤藓糖醇?配方奶混合液中乳酸代谢量的影响，初步探讨赤藓糖醇在配方奶中抑制La产酸的能力，以期为进一步研究和使用赤藓糖醇预防奶瓶龋提供依据。

材料和方法

一

主要材料和仪器

La国际标准菌株（LaATCC4356，上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市口腔医学重点实验室惠赠）；乳酸杆菌培养基（de Man， Rogosa and Sharp，MRS）肉汤、MRS培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司，双蒸水按比例调配后121.1 ℃高压灭菌）；赤藓糖醇（分子式C4H10O4，相对分子质量为122.12，保龄宝生物股份有限公司）；配方奶粉（“金智婴”婴幼儿配方奶粉，主要成分为蛋白质、脂肪、碳水化合物、钠等，香港明一营养食品国际集团股份有限公司）；无水乙醚（分析纯，南京利盛化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，阿拉丁，上海晶纯生化科技股份有限公司），乳酸（80%分析纯，阿拉丁，上海晶纯生化科技股份有限公司）；磷酸二氢钾（色谱纯，KH2PO4，相对分子质量136.09，阿拉丁，上海晶纯生化科技股份有限公司）；甲醇（色谱纯，西陇化工股份有限公司）；水相/有机相滤头（13 mm，0.22 μm，上海安谱科学仪器有限公司）；YQX?Ⅱ厌氧培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），超净工作台（SW?CJ?1FD 型，上海力申科学仪器有限公司），电子分析天平（Sartorius BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司），酶标仪（Heraeu，德国），高效液相色谱仪（SHIMADZU，LC?20AP，日本），进样针（25 μl，HAMILTON，瑞士），色谱柱（UltimateTM XB?C18，4.6 mm×250 mm，5.0 μm，Welch，美国）。

二

实验方法

1

实验溶液的配备

①用双蒸水配制1%、2%、4%、6%、8%的赤藓糖醇溶液于200 ml锥形瓶中，121 ℃高压灭菌15 min（赤藓糖醇焦化温度高于160 ℃）后迅速取出，按奶粉调配比例（150 g/L）加入奶粉（无菌操作台操作），混匀，105 ℃高压灭菌10 min，排气取出，37 ℃培养12 h，再次105 ℃灭菌10 min，涂板培养无菌后冷藏备用。②称取1.003 1 g乳酸（分析纯），用双蒸水定容于100 ml容量瓶中，取适量分别稀释1、1.5、2、4、10、20、40、100倍，0.22 μm水相滤膜过滤，超声振荡除去气泡。③配制0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH值为2.8，0.22 μm水相滤膜抽滤，超声振荡40 min；甲醇0.22 μm有机相滤膜抽滤，超声振荡40 min。

2

La的分组培养及样品制备

La常规复苏48 h后接种于MRS肉汤，37 ℃厌氧（80%N2、10%CO2、10%H2）培养18 h，涂片检查为纯培养后，以3 000 r/min（离心半径为9.3 cm）、4 ℃下离心15 min，弃上清液，磷酸盐缓冲液重悬，紫外分光光度计调540 nm处的吸光度值为1.0。将上述菌液按120体积比分别接种于赤藓糖醇质量分数为1%、2%、4%、6%、8%的赤藓糖醇（E）?配方奶（M）混合液（实验组）及不含赤藓糖醇的配方奶溶液（对照组）中，并将实验组依次命名为1% E?M、2% E?M、4% E?M、6% E?M及8% E?M组；37 ℃厌氧（80%N2、10%CO2、10%H2）培养，于4、8、12、16、20及24 h分别取各培养液（每个浓度3个平行管每管3 ml），3 000 r/min（离心半径为9.3 cm）、4 ℃离心15 min，取上清液，按11加入无水乙醚，用磷酸调pH值至2.0，3 000 r/min（离心半径为9.3 cm）、4 ℃离心10 min，取上清液，0.22 μm有机相滤头过滤，超声振荡去气泡，4 ℃冷藏备用。

3

绘制乳酸标准曲线

取各浓度系数的乳酸标准品10 μl进样于HPLC仪，记录保留时间及峰面积。色谱柱为C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾（98%）：甲醇（2%）；流速为0.5 ml/min；检测波长为217 nm；柱温30 ℃。以峰面积为Y轴，标品质量浓度（g/L）为X轴，绘制乳酸标准曲线，并计算其线性方程和相关系数R2。

4

样品的检测

取制备好的样品各10 μl进样于高效液相色谱仪，检测条件同上，根据保留时间确定乳酸的峰面积并记录。通过标准曲线计算样品中乳酸的质量浓度（g/L）。

三

统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件处理数据。对各组乳酸浓度进行方差分析；对同一时间点不同组间及同组不同时间点间的两两比较采用Tukey HDS检验，检验水准为双侧α=0.05。

结果

一

乳酸标准曲线

见图1，y=590 244x+67 507，R2=0.998 3。

二

乳酸的保留时间

乳酸标准品色谱图显示，10 min前出现的峰代表溶液中的溶剂峰，11.297 min可见一独立、对称峰，代表溶液中的乳酸（图2）；实验样品色谱图中，根据各浓度乳酸标准品中乳酸的保留时间，可确定样品中保留时间为11.2 min左右的峰为乳酸的峰（图3）。

三

各实验组及对照组乳酸代谢浓度的比较

见表1。

1

各组乳酸浓度均值的比较

各组各时间点总体均值间比较差异有统计学意义（F=187.448，P<0.05）；各组均值两两比较结果显示，除4% p="">0.05），其余组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

2

相同时间点各组乳酸浓度的比较

总体比较：同一时间点各组间差异均有统计学意义（P<0.01），见表1；两两比较：4 h时，对照组与各实验组间差异均有统计学意义（P<0.05），各实验组间两两比较差异均无统计学意义（p>0.05）； 8 h时，除1% E?M与2% E?M组、4% E?M组与6% E?M组间差异无统计学意义（P>0.05），其余组间差异均有统计学意义（P<0.05）；12 h时，4%、6%、8% E?M组与对照组及1% E?M组相比差异均有统计学意义（P<0.05）；16 h与4 h时情况相同； 20 h时，对照组与1% E?M组，1%、2%及8% E?M三组间两两，4% E?M组分别与6%、8% E?M组相比差异均无统计学意义，其余各组间差异均有统计学意义（P<0.05）；24 p="">0.05），其余各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。

3

同组内不同时间点乳酸浓度的比较

总体比较：同组内不同时间点相比差异均有统计学意义（P<0.01）。两两比较：对照组、2% E?M组、8% E?M组同组内各时间点两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；1% 12="" 16="" p="">0.05），其他各时间点差异均有统计学意义（P<0.05）； 4="" 8="" 12="" 16="" p="">0.05），其余各时间点差异均有统计学意义（P<0.05）。

讨论

赤藓糖醇与其他糖醇类相比，具有以下几个优点：①低热量值，能量值仅为0.84 kJ/g，是所有多元糖醇甜味剂中能量值最低的一种；②高耐受量、无毒副作用，进入机体的赤藓糖醇80%会迅速被小肠吸收，避免了腹泻、腹胀等肠道不适；③吸湿性低[11?12]；④抗龋性[2?3]。本课题组前期研究显示，赤藓糖醇溶液可以抑制变形链球菌的生长繁殖、产酸以及在菌斑形成过程中的黏附[5?9]。

牙菌斑内细菌代谢产物中的糖在短时间内可产生大量有机酸，使牙釉质中的无机盐溶解，这是龋病发生的直接原因。在流行病学中被称为“龋标志菌”的乳杆菌，其同型发酵菌种的代表菌有嗜酸乳杆菌，它们与龋病密切相关，且有很高的耐酸力[10]。Byun 等[13]和Chhour等[14]研究发现，在成年患者龋病进展部位乳杆菌数量明显多于变形链球菌。La主要发酵产物为乳酸，副产物为丙酸、乙酸、丁酸、甲酸和微量的丙酮酸。研究发现，乳酸、乙酸、丙酸均具有较高的致龋性，且在龋齿易感人群的牙菌斑生物膜中可检测到较高浓度的乳酸[15]。近年来有研究证明，咀嚼木糖醇、山梨醇口香糖可减少牙菌斑中的乳杆菌数量[16]。但目前关于糖醇对乳杆菌作用的研究还较少。本实验通过检测乳酸代谢量观察赤藓糖醇对La产酸的抑制性。

目前，有机酸的检测方法主要有气相色谱法、离子色谱法和HPLC。HPLC是20世纪60年代中期得到迅速发展的一种分离、分析技术。适宜于挥发性低、相对分子质量大的化合物或离子型化合物。具有使用范围广、分离效率高、速度快、准确性及特异性高等特点[17]。HPLC技术目前已逐渐应用于口腔医学研究中，如Badet等[18]采用HPLC技术对木糖醇的酸性产物通过记录培养基上pH值的变化判断唾液中乳杆菌株对木糖醇的适应性。

本项研究运用HPLC对La在赤藓糖醇?配方奶混合液和配方奶溶液中乳酸的代谢量进行分析，结果显示加入赤藓糖醇的配方奶溶液中乳酸代谢量显著小于对照组；且高质量分数组（4%、6%、8%）乳酸代谢量显著小于低质量分数组（1%、2%），即赤藓糖醇对La在配方奶中产酸的抑制作用高质量分数组强于低质量分数组。这与本课题组前期研究赤藓糖醇对变形链球菌作用的结果基本一致[5?9]。

La为乳杆菌中的同型发酵菌种，对糖的代谢类型为糖酵解途径（embden meyerh of pathway， EMP）。EMP途径是绝大多数生物的主流代谢途径。葡萄糖分子经细菌代谢后生成二分子丙酮酸，二分子NADH2和四分子腺苷三磷酸。同型发酵菌可以直接从EMP途径的产物丙酮酸出发进行同型乳酸发酵产生乳酸，并且经过丙酮酸脱氢酶系进入三羧酸循环，为菌体生长提供足够的能量及中间产物。

乳杆菌对糖醇的分解代谢不同于糖类,它们依靠一个具有底物特异性的磷酸转移酶系统（phosph?ortransferase systems，PTS）将木糖醇、核糖醇（以及D?阿拉伯糖醇）主动运输进入细胞，然后进行磷酸化等系列生化反应生成终产物乳酸、乙醇或乙酸[19]。关于木糖醇的防龋机制已有广泛研究。木糖醇经果糖磷酸转移酶系统进入细胞，磷酸化成为5?磷酸木糖醇并在细胞中形成积累，再经脱磷酸成为木糖醇并被排出体外，这样形成一个无效循环，从而对糖酵解形成竞争抑制，抑制细胞的生长，并且可以抑制细菌发酵其他糖类[20?21]。考虑赤藓糖醇与木糖醇的同属关系及在抑菌方面的相似性，推测赤藓糖醇的抑菌产酸机制和木糖醇相似，即在糖醇进入细菌体内后被磷酸化，其产物抑制糖代谢所需酶的活性，进而使其产酸力下降。但由于赤藓糖醇为四碳糖（C4H10O4），有别于五碳糖的木糖醇（C5H12O5），所以其抑菌机制还有待进一步研究。

综上所述，赤藓糖醇对La在配方奶中产酸有抑制作用，并且对嗜酸乳杆菌发酵配方奶中的多糖产生竞争抑制作用，加上赤藓糖醇易吸收、耐受性高等特点，本项研究结果为其添加于配方奶粉中用于龋病预防提供了一个新的可能。

中英文摘要及参考文献（略）

（收稿日期：2014-12-04）

（本文编辑：孔繁军）