[摘要]  半胱氨酸组织蛋白酶是组织蛋白酶家族的主要成员。牙本质酸蚀脱矿后裸露的胶原纤维被内源性蛋白酶降解是影响牙本质粘接耐久性的主要因素之一。除基质金属蛋白酶外，半胱氨酸组织蛋白酶也在粘接过程中被激活并参与混合层中胶原的破坏。本文就半胱氨酸组织蛋白酶与基质金属蛋白酶的相互作用、在牙本质粘接中的作用以及半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂对提高牙本质粘接耐久性的作用的研究进展作一综述。

[关键词]  半胱氨酸组织蛋白酶；牙本质粘接耐久性；基质金属蛋白酶；半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂

随着微创修复理念的发展，口腔临床医生及患者对粘接效果的要求越来越高。现今，牙本质粘接剂已具备理想的即刻粘接性能，但远期粘接效果仍不能令人满意。目前认为牙本质酸蚀脱矿后裸露的胶原纤维被内源性蛋白酶降解是影响牙本质粘接耐久性的主要因素之一[1]，无论是在全酸蚀或自酸蚀的粘接过程中都存在内源性蛋白酶的激活[2-3]。在牙本质内源性蛋白酶中，得到较为深入研究的是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），一些研究发现半胱氨酸组织蛋白酶（cysteine cathepsin）也参与了牙本质粘接界面的破坏。

半胱氨酸组织蛋白酶的种类与特性

组织蛋白酶（cathepsin，Cath）属于溶酶体中的水解细胞内蛋白质的木瓜蛋白酶类肽链内切酶[4]，也属于细胞外降解Ⅰ型胶原和蛋白多糖的外肽酶[5]。人体中至少存在11种Cath，已被证实的有CathB、CathC、CathF、CathH、CathK、CathL、CathO、CathS、CathV、CathW 和CathX[6]。根据蛋白质水解机制进行分类，Cath成员中大部分属于半胱氨酸组织蛋白酶（如CathB、Ca thC、CathK、CathH、CathL和CathS），少数为天冬氨酸组织蛋白酶（如CathD和CathE）和丝氨酸组织蛋白酶（CathA和CathG）。半胱氨酸组织蛋白酶都是以无活性的酶原形式合成并通过甘露醇-6-磷酸受体途径转运至细胞内。阴离子多糖（如黏多糖、硫酸葡聚糖）能够促进其自催化激活[7-8]。半胱氨酸组织蛋白酶是一类在弱酸性环境中易被活化，在碱性和中性溶液中不稳定的糖蛋白；其蛋白质水解活性受到一系列内源性抑制剂的调节。半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）家族成员，如表达于细胞内的内源性抑制剂stefinA和stefinB以及表达于细胞外的cystatinC、cystatinD 和cystatinF都可以调节相应的半胱氨酸组织蛋白酶的活性[9]。

半胱氨酸组织蛋白酶的生理作用

半胱氨酸组织蛋白酶可降解细胞外基质中的蛋白质，如胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白多糖。此外，它还参与激活某些前体蛋白或蛋白酶系统，参与骨骼与细胞外基质重建以及血管增殖等多方面生理、病理过程，与人类肿瘤、骨质疏松症、关节炎、动脉粥样硬化等多种重要疾病密切相关[10-11]。CathK在成骨细胞及破骨细胞中高水平表达，参与了牙周病及种植体周围炎骨吸收过程[12-14]。Nascimento等[15]的研究表明，龋坏牙本质中CathB的含量比在正常牙本质中高近10倍，并随着牙本质龋损深度的增加，其活性增加。这提示CathB参与了龋坏牙本质降解过程。可见，半胱氨酸组织蛋白酶在口腔中的生理、病理过程中也发挥着重要的作用。

半胱氨酸组织蛋白酶与MMP的相互作用

MMP是一类钙锌依赖性肽链内切酶，几乎可降解所有细胞外基质蛋白。其中MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9及MMP-20已被证实存在于牙本质中[16]。研究[17]表明MMP在牙本质粘接耐久性降低中起重要作用。CathS与MMP之间可能存在相互激活、相互协同的作用。研究[18]显示MMP可激活CathB前体蛋白，活化的CathB将进一步激活牙龈成纤维细胞的MMP-1。黏多糖可通过直接激活半胱氨酸组织蛋白酶和促进其与作用底物相结合来调节酶活性。MMP（如 MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-8、MMP-9 和MMP-13）能与前列腺素及黏多糖结合，从而抑制半胱氨酸组织蛋白酶的作用[19]。相反，MMP-3通过分解前列腺素的异聚体参与半胱氨酸组织蛋白酶激活[20]。因此，MMP–PG/GAG复合体在牙本质胶原生理代谢中具有重要作用。同样的，半胱氨酸组织蛋白酶可以激活MMP。半胱氨酸组织蛋白酶在酸性条件下激活后，可以切除Ⅰ型胶原的C-末端肽，暴露胶原的切割位点，使胶原能与MMP结合[21]。因此，牙本质可能存在Cath与MMP的相互作用，MMP和Cath可能共同参与粘接界面裸露的牙本质胶原的降解。

半胱氨酸组织蛋白酶与牙本质粘接的关系及可能机制

由于牙本质小管中液体的流动，粘接剂中小分子的聚合物可以渗透其中，而牙本质小管液中含有的蛋白酶可能参与混合层中胶原的降解。Lehmann等[22]发现，在使用自酸蚀粘接系统时，成牙本质细胞的MMP-2表达增加。他们认为成牙本质细胞可能通过增加蛋白酶的合成参与混合层的破坏。Zhang等[23]发现不同粘接过程可对半胱氨酸组织蛋白酶的活性产生影响，酸蚀及酸蚀-冲洗粘接法能降低Cath活性，而自酸蚀粘接法则增加其活性。另外，研究[24]表明黏多糖存在于牙本质中，并在牙本质酸蚀及胶原降解时释放，提示其在粘接过程中直接参与牙本质中半胱氨酸组织蛋白酶的活化。

近期的研究表明，成牙本质细胞及牙髓组织中含有编码大部分组织蛋白酶的DNA序列，存在CathB、CathK等多种Cath的表达；CathB是牙髓组织和成牙本质细胞培养过程中稳定并且高水平表达的Cath。CathB密集分布于牙髓组织和成牙本质细胞中，在牙本质小管区同样可见分布，并集中分布于管周牙本质区[25]。CathB存在于牙本质小管中，并在龋坏牙本质中表达增加，且与MMP的活性具有高度相关性，据此可以推断其在牙本质龋坏中具有重要的作用[26]。因为龋坏而需要修复的患牙较多，通常牙髓具有局部轻微的炎症，所以牙本质-牙髓复合体产生的MMP和半胱氨酸组织蛋白酶可能也是混合层降解的重要原因。

半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂在提高牙本质粘接耐久性方面的应用

MMP与半胱氨酸组织蛋白酶共同存在于牙本质-牙髓复合体中，推测这两种蛋白酶共同参与牙本质内源性蛋白酶的水解活动，使用MMP及半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂可保护粘接界面。许多研究致力于寻找有效的酶抑制剂。有研究[27]表明氯己定能有效抑制MMP，提高粘接耐久性。MMP的活性位点包含半胱氨酸重复序列，其中包括组氨酸残基及相邻的谷氨酸残基，对其催化作用至关重要。由于谷氨酸是二羧酸，即使在生理状态pH条件下，谷氨酸形成多肽后仍携带1个自由的负电荷羧基。氯己定通过其阳离子与MMP活性位点中的阴离子结合，从而抑制其活性作用。近年来的研究表明氯己定可以抑制人重组及牙本质来源的半胱氨酸组织蛋白酶的活性，并呈浓度依耐性。其机制可能为氯己定可有效地结合CathB、CathK和CathL中的活性基团，从而阻止其蛋白质水解活动[28]。

季铵盐甲基丙烯酸酯（quaternary ammonium methacrylate，QAM）的作用机制与氯己定相似，QAM通过其阳离子与MMP活性位点结合而抑制MMP活性。Tezvergil-Mutluay等[29]检测各种外源性半胱氨酸组织蛋白酶（CathB、CathK、CathL和CathS）及QAM处理牙本质后，MMP及半胱氨酸组织蛋白酶降解胶原特异性产物——Ⅰ型胶原交联羧基末端肽和Ⅰ型胶原吡啶交联终肽，15%的2-丙烯酰氧基氯处理后可减少Ⅰ型胶原交联羧基末端肽的生成，从而推测其可抑制半胱氨酸组织蛋白酶的活性。

另外，E-64是从曲霉中获得的一种不可逆的、有效的、高选择性的半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂，目前已大量应用于科学研究中。其机制可能为E-64不可逆地与半胱氨酸组织蛋白酶的活性巯基结合后形成硫醚连接。杨伟湘等[30]研究发现，添加组织蛋白酶抑制剂E-64未对牙本质与树脂即刻粘接强度产生影响，老化处理后，E-64可提高树脂粘接强度，保持胶原的相对完整，提高牙本质粘接耐久性。

综上所述，半胱氨酸组织蛋白酶与MMP共同参与牙本质粘接界面中裸露胶原蛋白的降解，其抑制剂的使用将成为提高牙本质粘接耐久性的新方法。然而，目前关于半胱氨酸组织蛋白酶与MMP在牙本质粘接过程中活化及相互作用机制的认识尚不明确。更好地了解其作用机制对理解牙本质混合层破坏过程及寻找提高牙本质粘接耐久性的方法具有重大意义。

来源： 廖文婷 李彦 国际口腔医学杂志