3D激光扫描显微镜下牙本质龋微结构的观察和分析

作者：许立侠  徐红梅  朱晓英 孙丽梅

作者单位：武警总医院口腔科，北京 100039

[摘要]  目的  通过3D激光扫描显微镜观察牙本质龋的微结构，为临床上龋病的防治及相关研究提供形态学理论依据。方法  收集6颗新鲜拔除的有龋坏的第三磨牙，均制备成横剖面标本，在3D激光扫描显微镜下进行光学、激光彩色及3D形貌图的观察。结果  在样本整体结构中，光镜下可见病变组织的轮廓，激光彩色镜下较清晰分辨两层牙本质病变；在微结构中，激光彩色图下可以观察到透明层牙本质小管部分闭合，脱矿层管周和管间牙本质数目较少，细菌侵入层管周和管间牙本质均破坏，相邻小管融合，呈串珠样和椭圆形病灶，坏死崩解层无正常牙本质结构。3D形貌图下可根据颜色的不同观察到四层结构。结论 3D激光扫描显微镜能够分辨牙本质龋的两层病变组织结构，观察到牙本质四层结构中牙本质小管、管周、管间牙本质的不同改变，是观察牙本质微结构的有力工具。同时牙本质龋微结构的形态对临床上龋病的防治及相关研究具有理论指导意义。

[关键词]  牙本质龋； 3D激光扫描显微镜； 小管； 微结构

牙本质是位于釉质和牙髓之间的夹层结构，富含牙本质小管，当牙本质龋坏病变时，小管结构的改变尤为突出。研究者们根据临床经验和实验方法的不同将牙本质龋坏分为不同层次。Ogushi等[1]将牙本质龋分为内外两层：外层为细菌感染层，无机物脱矿，有机物分解，不能再矿化，临床上应该彻底去除；内层无细菌，无机物稍微脱矿，有机物未分解，可以再矿化，临床上可以保留。而现在多数学者[2]将牙本质龋的病变在组织学上由病损深部向表面分为透明层、脱矿层、细菌侵入层和坏死崩解层。还有的学者[3]将牙本质龋变层描述为粉色、淡粉色、透明色和基本正常。但每一层的微结构变化均不同。早期对于牙本质龋病结构的观察是通过透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）[4]，近年来原子力显微镜的应用较为普遍，但这些方法均有不足。TEM观察前需对标本脱水及真空处理会导致结构的改变，且仅能以黑白色进行观察，不能够反映样本的真实结构。原子力显微镜虽能够反映样本的真实结构，但要求标本的表面光滑细致，且扫描图貌耗时长。3D激光扫描显微镜作为微纳米科学研究的重要工具之一，近年来在口腔生物材料的研究领域中获得了国内外学者的青睐[5]。本文运用3D激光扫描显微镜对牙本质龋整体和局部微结构进行分析，为研究牙本质龋的相关实验奠定基础，也对临床上牙本质浅龋的再矿化治疗提供一定的形态学理论依据。

1  材料和方法

1.1  实验材料和设备

Hank’s平衡盐溶液[6]（Hanks balanced salt solution，HBSS）：400 mg·L-1KCl、60 mg·L-1 KH2PO4、8 000 mg·L-1 NaCl、1 000 mg·L-1葡萄糖、90 mg·L-1 Na2HPO4·7H2O、350 mg·L-1 NaHCO3、140 mg·L-1CaCl2、100 mg·L-1 MgSO4·7H2O和100 mg·L-1 MgCl2·6H2O；3D激光扫描显微镜（Keyence公司，日本）。

1.2  离体牙的收集

收集武警总医院口腔颌面外科拔出的新鲜第三磨牙，从中挑选出6颗平滑面龋（图1）。

龋坏均为白垩色，患者年龄20~35岁，患者均知情同意并签署同意书。去离子水下用洁牙机超声清洗表面软组织和牙石，冲洗干净后置于HBSS溶液中4 ℃保存备用，2周内使用。

1.3  牙齿标本的制备

将收集的离体牙用硬组织切割机将牙体组织通过病变区域沿中线纵切，暴露出牙本质龋变横剖面（图1）。然后用环氧自凝树脂包埋各牙齿并标记，抛光机及240、320、600、800、1 000号碳化硅砂纸在流水下依次磨平、抛光后，超声下振荡清洗5 min，冲洗吹干后在3D激光扫描显微镜下进行光学显微、激光彩色及3D形貌图的观察比较。

2  结果

2.1  牙本质龋整体结构的形貌观察图

在光学显微形貌图中（200倍和400倍）可以观察到病变组织由釉质龋沿釉牙本质界扩展而来的牙本质龋的大体轮廓，外层颜色较深，而内层颜色稍淡。但在1 000倍下形貌分层模糊不清。在激光彩色形貌图中可清晰地观察到龋坏病变分为两层，1000倍下分层明确，牙本质小管也清晰可见，牙本质小管大多管腔开口，散落在整个牙本质中；也有呈管束状的牙本质小管（图2）。

2.2  牙本质龋微结构的激光彩色图

在3 000倍下的激光彩色图中可以观察到牙本质龋四层微结构的变化（图3）。正常牙本质小管管腔清晰，管周牙本质明显，管间牙本质结构完整（图3a）。位于牙本质龋最深层的透明层，牙本质小管变窄，有的完全阻塞（图3b）；透明层表面的脱矿层，牙本质小管形态较完整，管周牙本质和管间牙本质数目减少，管周可见较大的白色矿物质沉积物（图3c）；近脱矿层的细菌侵入层，局部小管管壁膨胀，扩张变形，管周牙本质被压迫，管间牙本质破坏，相邻小管相互融合，呈串珠样结构。病变进一步进展，被破坏的小管进一步融合，形成椭圆形的液化坏死灶（红色弯曲箭头所示）；釉牙本质界处的坏死崩解层，几乎无正常牙本质结构，完全崩解破坏，为全黑色空隙，龋洞从釉牙本质界处形成。

2.3  牙本质龋微结构全貌3D形貌图

1 000倍下以3D格式显示激光彩色形貌图，以不同颜色显示3D图像的色阶，左侧颜色条显示与颜色对应的高度值，红色光标（用于上限）和蓝色光标（用于下限）。牙本质从釉牙本质界处到健康牙本质组织的颜色由蓝色向红色过渡，即高度由低向高过渡；釉质牙本质界处组织凹陷，以蓝色居多，高度较低（图4）。

2.4  牙本质龋微结构局部3D形貌图

3 000倍下以3D格式显示的激光彩色形貌图更立体形象地显示了各层牙本质龋变及微结构的形态变化。同样以不同颜色显示3D图像的色阶，红色区域可代表正常牙本质，淡红色和橙黄色区域可代表牙本质龋的内层即透明层和脱矿层，黄绿色区域和蓝色及尖峰状区域可代表牙本质龋的外层即细菌侵入层和坏死崩解层（图5）。

3  讨论

3.1  3D激光扫描显微镜的成像原理

3D激光扫描显微镜以微纳米尺度对样品三维表面形貌进行测量，测量精度可达到0.001 μm。其成像原理采用了“激光光源”和“白色光源”2路光源方式。通过这2个光源获得构建彩色全焦点图像、激光全焦点图像、高低图像所必要的色彩、光量、高度的信息。首先通过短波长激光检测反射光量和高度。从激光显微系统的激光光源发出的光线经由XY扫描光学系统、接物透镜聚光至对象物体上。聚光后的点光源通过XY扫描光学系统在观察视野内进行面扫描。在观察视野内分割成1 024×768像素运行扫描，并由受光组件检测各像素的反射光。将接物透镜在Z轴方向上驱动，反复运行面扫描，获得各像素的各Z轴位置处的反射光量。将反射光量最高的Z轴位置设为焦点，检测高度信息和反射光量。这样便可获得整体对焦的光量全焦图像和高低图像信息。其次，使用彩色电荷耦合器件（Charge Coupled Device，简称CCD摄像机）检测白光源的发射光。CCD摄像机在每个像素的基础上，使用激光束获取焦点位置的颜色信息。前期实验应用3D激光显微镜观察到早期釉质龋的纳米结构，釉柱头部晶体变大，釉质间隙增宽，釉柱鞘连续性中断等显著变化[7]。

3.2  牙本质龋微结构形态的分析

由于点隙窝沟解剖结构的复杂性，会干扰龋变的形态学研究，所以本实验以平滑面龋为实验对象。牙本质龋多是由釉质龋进一步向深层发展而来，部分也可由牙根部牙骨质龋发展所致。牙本质全层存在牙本质小管，龋损沿釉牙本质界扩散，同时沿牙本质小管进展，病程较快。牙本质龋中小管的改变较为突出，是研究牙本质龋病变的主要分析对象。

在整体结构中，光学显微镜下仅能在低倍镜下观察到病变组织的大体轮廓，高倍镜下分层结构模糊不清，微结构改变更是难以辨识。而在激光彩色图貌中，不仅低倍镜下病变组织分层明确，高倍镜下牙本质小管清晰可见，病变组织处的牙本质小管数目减少，釉牙本质界处龋损也很明确。

在微结构中，激光彩色形貌图可清晰地观察到牙本质小管、管周牙本质、管间牙本质等微结构的变化。接近正常组织的透明层牙本质小管管腔变窄，部分小管完全阻塞。而近透明层处仍可见正常牙本质小管，管周牙本质明显，管间牙本质结构完整。透明层又称为硬化层，是牙本质龋最早出现的改变，由于牙本质小管管腔中有矿物质沉积，使小管管腔变窄，随着矿物质沉积增多，最终将牙本质小管管腔完全阻塞。Ogawa等[8]在显微硬度分析中发现，此层硬度和正常牙本质相比较低，表明透明层存在一定的脱矿。本实验观察到管周和管间牙本质的无机物降解现象，而激光彩色（光学）形貌图是一种在测量后用激光强度图像和光学图像合成的全幅对焦光学图像，用颜色对各高度像素进行标示，由CCD相机按每1像素分别提取，再转换成激光高分辨率图像。牙体组织的脱矿、矿物质溶解等可能导致牙本质表面高度的改变，从而在激光彩色形貌图中体现出颜色的改变。脱矿层中牙本质小管的形态较完整，但直径相对变大，管周和管间牙本质数目减少，说明存在脱矿现象。有部分管周牙本质小管有白色较大矿物质沉积，表明同时存在再矿化现象[9]。而在临床上洞型制备时是否保留此层深部质硬的牙本质一直存在争议。Iwami等[10]研究表明脱矿层虽已脱矿软化，但部分软化牙本质是无菌的。Besinis等[11]研究也表明软化牙本质可再矿化。此外，保存此层牙本质并随后充填，即使存在一些受感染的牙本质，只要充填物保持完整，病变即不会进展。因此在脱矿层软化牙本质深方质硬且着色的牙本质在洞型制备时不需去除。而冯希平[12]在牙体充填后继发龋的产生和预防中总结出绝大多数充填体再次充填是因为原发性龋病，因此认为应将这些软化牙本质彻底去除。细菌侵入层可观察到小管管壁肿胀、扩张变形，相邻小管相互融合，呈串珠样外观等破坏轻微的现象。同时可看到被破坏的小管进一步融合，形成椭圆形坏死灶等破坏较严重的阶段。造成细菌侵入层现象的原因是由于细菌侵入，小管内细菌大量繁殖，小管壁脱矿，蛋白溶解，局部小管由于细菌团块的增加，管壁膨胀扩张变形，管周牙本质首先被压迫，随后压迫管间牙本质，随着管周和管间牙本质的脱矿加剧，胶原纤维变性分解，管周牙本质破坏，相邻小管融合呈串珠样外观。病变进一步发展，被破坏的小管持续融合，形成椭圆形的坏死灶。此层内有细菌感染，临床上应该彻底清除。在坏死崩解层，几乎无正常牙本质结构，釉牙本质界处龋洞形成。

透明层、脱矿层、细菌侵入层、坏死崩解层的形成是一种动态的过程，很难具体划分界限，而3D激光扫描显微镜记录一个样品在最大光强度时每个像素的光电倍增管激光强度数据和实际高度数据（一种内置光学线性刻度值）。以不同颜色显示3D图像的色阶，颜色色阶对应相应的高度值。3D显示时，能够以立体镜方式查看图像。牙本质龋中矿物质溶解，可能会使牙本质表面高低发生改变。因此在3D形貌图中，可以通过颜色的不同大体区分不同组织病变，而且立体形象。红色区域可代表正常牙本质；牙本质龋的内层即透明层和脱矿层，脱矿程度较轻微，可呈现出淡红色和橙黄色；黄绿色区域和蓝色及尖峰状区域可代表牙本质龋的外层即细菌侵入层和坏死崩解层，龋坏脱矿较严重。

综上所述，本研究应用3D激光扫描显微镜可以观察到牙本质龋四层牙本质小管、管周和管间牙本质等微结构的不同改变，进一步验证了内层即透明层和脱矿层，虽有少量微结构脱矿，但存在再矿化现象，为进一步研究牙本质龋的相关实验奠定基础，也对临床上牙本质浅龋的再矿化治疗提供了形态学理论依据。

来源：《华西口腔医学杂志》2016年10月第34卷第5期