来源：《华西口腔医学杂志》2018年4月第36卷第2期
作者：孙同正1 滕飞2,3 贾松菠1 唐永平1 姜明1 黄适2 袁晓1 李晓岚3 杨芳1,3
作者单位：
青岛大学附属青岛市市立医院口腔医学中心，青岛 266071；
2.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，青岛 266100；
3.中山大学广东省口腔医学重点实验室，广州 510055
[摘要] 目的 通过高通量测序技术研究重症低龄儿童龋病和健康者唾液的菌群结构及其差异。方法 在青岛市崂山区儿童中，经口腔检查选取健康（H组）和重症低龄龋病（C组）儿童各24名，采取唾液样本，提取其DNA进行聚合酶链式反应扩增，利用454测序平台对16S rRNA V1—V3区进行双端测序，对细菌群落结构及多样性进行差异分析。结果 C组唾液菌群物种丰度高于H组（P<0.05），两组唾液菌群结构的差异有统计学意义（P<0.01），且C组的群落结构更为相似和保守（P<0.001）；鉴别出C组高表达的可疑致龋微生物（P<0.1）及H组高表达的健康相关微生物（P<0.1）；基于唾液菌属图谱建立的龋病风险评估模型区分健康和龋病者的准确率可高达70%以上。结论 唾液菌群和特定细菌种类，如比例升高的Prevotella菌属有助于评估和筛选低龄儿童龋病风险。
[关键词] 低龄儿童龋； 口腔菌群； 唾液； 元基因组学
开 篇
龋病是发生在牙齿的慢性感染性疾病，其中低龄儿童龋（early childhood caries，ECC）是影响儿童口腔健康的最主要的慢性疾病之一[1]。ECC不仅影响儿童期口腔健康，还可以引发一系列的感染和疼痛，严重影响患者的生活质量[2-3]。世界卫生组织对186个国家的人群口腔健康进行长达20年的纵向调查，结果显示：在大部分国家，龋病仍影响着60%~90%的学龄儿童[4]。因此，针对龋病的病因学研究、风险评估乃至预防策略都是当今研究的重点问题[5]。
人类与其体内共生的微生物（即共生菌群，亦称人体微生物组）共同组成一个超级生物体，而口腔的健康与疾病状态依赖于宿主与口腔微生物群落之间的相互作用[6]。龋病四联因素学说认为，细菌、环境、宿主、时间均是龋病发生的必要条件，细菌是其中一项重要环节。2000年以来，获得越来越多学者认同的“生态菌斑假说”[7]亦为龋病的微生物病因学研究提供了新切入点。口腔菌群是人体内最复杂的微生物群落之一，其中绝大多数微生物不可培养[8]。由于技术手段和分析策略的局限性，极大地限制了对龋病根源进行全面而精准地解析。近年来，人类微生物组学计划的深入开展和高通量测序技术的迅猛发展为口腔菌群研究提供了前所未有的崭新视野，同时为龋病的微生物病因学的深入认知带来了新契机。
本研究采用新一代的高通量生物技术（454 GS FLX Titanium）并结合多元统计分析手段，旨在全面解析口腔唾液微生物群落的生态特征，并对重症低龄龋儿童及健康儿童的唾液菌群进行相互比较分析，探讨可能的参与龋病发生发展的微生物因素。
1、材料和方法
1.1 样本采集
1.1.1 采样对象的选择 2016年4—5月对青岛市崂山区幼儿园儿童进行口腔检查，筛选出24名重症低龄儿童龋（severe early childhood caries，S-ECC）儿童（C组）和24名健康儿童（H组）参与本研究。C组儿童要求龋失补牙指数（decayed, missing, and filled teeth，dmft）≥10，H组要求dmft=0；两组儿童年龄均在4岁左右，其中男24名（健康和疾病人数的比例为1∶1），女24名（健康和疾病人数的比例为1∶1）。所有儿童要求检查前1个月未服用抗生素，口唇黏膜颜色、质地均未见异常，没有发育畸形及全身性疾病等先天疾病，近1个月内未佩戴口腔活动矫治器。整个实验流程各项细节及以后的数据发表均得到青岛大学医学伦理委员会批准，同时征得儿童监护人同意。
1.1.2 样本采集方法 口腔检查：由两名牙体牙髓专科医生以视诊结合探诊的方式进行检查，检查器械均经高温高压严格灭菌消毒。在检查前统一认识、方法和标准，标准一致性检验的Kappa值均大于0.83。采用世界卫生组织《口腔健康调查基本方法》（1997年）对龋病的诊断标准诊断龋病。
唾液收集：筛选进入研究的儿童取样前一晚及当天早晨不刷牙，上午9时进行样本收集。取样时，嘱儿童把自然、未受刺激的唾液缓慢吐入无菌50 mL离心管中，持续5 min，对样品分别编号，封口至4 ℃采样样品保存箱，置于-80 ℃冰箱中保存。
1.2 基因组DNA提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及测序
采用DNeasy® Blood and Tissue kit（Qiagen公司，美国）试剂盒纯分离样本中基因组DNA，定量测定其浓度，检测纯度，并电泳检测DNA完整性，保存于-80 ℃。选取16SrRNA片段上V1—V3高变区（Escherichia coli positions 5—534）作为扩增目标片段进行PCR扩增。按照Qiagen MiniElute试剂盒提供的操作流程进行回收并纯化目的片段DNA，溶解于20 μLTE液洗涤[9]，利用454 GS FLX Titanium平台进行双端测序。
1.3 数据分析
利用本实验室已经建立的454高通量序列处理流程，利用MOTHUR（https://www.mothur.org/）软件对得到的原始序列进行质量控制[9]。
1.3.1 群落结构分析 基于操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）结果计算物种丰度估计指数（Chao1）及物种多样性指数（Shannon和Simpson），以展示口腔唾液菌群的α多样性。通过计算任意两个样品的Bray-Curtis距离，构建Bray-Curtis矩阵并进行主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA），以展示C组和H组间的物种结构特征（β多样性）。
1.3.2 物种的种系发育信息分析 从门到种水平进行细菌种系信息划归。利用RDP Classifier分类工具，比对Greengens数据库（http://greengenes.secondgenome.com/），选取置信度0.8为临界阈值，低于该临界值即列为未分类细菌，并计算每个门类各物种的相对丰度。
1.3.3 统计学分析 所有统计分析采用R（Version 3.2.1）软件包进行。两组间比较采用Wilcoxon ranksum检验，多重比较采用Bonferroni检验校正（P<0.1认为差异具有统计学意义）。采用多因素方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）检测疾病状态和性别对菌群结构的影响程度。所用模型算法为机械学习的随机森林（random forest，RF）法，预测能力通过受试者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，模型区分能力则利用ROC曲线评估（area under the curve，AUC）进行分析。
2、结果
采用多样本平行标记技术对儿童口腔唾液样品进行分析，得到约400 bp长的序列。经初步筛选，共获得270 395条序列，每个样品平均得到5 634条序列。
2.1 基于OTU的菌种多样性分析
由图1可见：H组与C组的Shannon和Simpson指数无明显差异（P>0.05），但两组的Chao1指数差异有统计学意义，且C组明显高于H组（P<0.05）；不同性别的α多样性指数的差异均无统计学意义（p>0.05）。
2.2 基于Bray-Curtis的群落结构特点
H组和C组唾液微生物群落结构见图2。首先，龋病状态会显著影响唾液菌群结构（F=2.76，P<0.01），而性别对唾液菌群结构没有明显影响（p>0.05，图2左）；其次，H组和C组的菌群结构存在差异（P<0.01），且C组儿童的群落结构更为相似和保守，而H组则相距较远且更为分散（P<0.001，图2中）；最后，进一步通过距离矩阵进行PCoA分析，可以在P1主坐标看到两组人群的分离趋向（P<0.01，图2右）。
2.3 基于种系发育信息的群落特点
对H组和C组唾液的菌群微生物相对丰度进行比较分析，结果见图3。在细菌门水平，两组样品的组成成分都较为近似，超过99%的群落成员由以下6个优势细菌门构成，包括厚壁菌门（Firmicutes，42.55%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，24.50%）、变形菌门（Proteobacteria，16.76%）、放线菌门（Actinobacteria，9.51%）、梭杆菌门（Fusobacteria，4.94%）、TM7（1.18%）；但H组和C组在门水平上的物种组成无明显差异。
在门、纲、目、科、属、种6个分类水平，分别对不同性别来源和不同疾病状态的人群进行比较，未发现性别相关的细菌种类；在H和C组间比较，未发现龋特异性细菌种类（单独存在于某一方人群，而另一方人群中缺失），但从纲到属4级水平均检测到相对丰度存在显著差别分布的细菌种类（图4）。
由图4可以总结出两组高表达的微生物。1）C组高表达的微生物，即可疑致龋微生物（P<0.1）：拟杆菌纲（Bacteroides）、拟杆菌目（Bacteroidales）
、普氏菌科（Prevotellaceae）以及普氏菌属（Prevotella）；2）H组高表达的微生物，即健康相关微生物（P<0.1）：黄杆菌纲（Flavobacteria）、黄杆菌目（Flavobacteriales）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、棒状杆菌科（Corynebacteriaceae）、伯杰菌属（Bergeyella）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和链球菌组（Streptococcaceae Group）。
2.4 利用唾液菌群建立S-ECC儿童龋病的评估模型
基于S-ECC儿童龋病时口腔菌群表现出明显改变的结果，笔者利用RF法基于唾液菌群种系发育属水平上的全部物种以及筛选出来的4个潜在的龋病生物标记物 （Prevotella、Bergeyella、Corynebacterium、Streptococcaceae Group）建立评估模型，结果见图5。由图5可见，基于所有唾液细菌属信息建立的龋病评估模型（图5左，AUC=0.88，准确率为0.79）区分健康和龋病的性能略优于基于4个细菌属信息建立的评估模型（图5右，AUC=0.78，准确率为0.73），提示该细菌属作为低龄儿童龋病风险评估模型具有应用潜能。
3 讨论
首先，本研究考察了S-ECC儿童和健康儿童的唾液菌群物种多样性差异，发现两组的物种多样性指数Shannon和Simpson均无差异，这与之前的研究结果一致[10-12]；但C组的唾液菌群物种丰富度（Chao1指数）显著高于H组，提示口腔的龋病状态与唾液微生物的物种丰富度存在一定关系，但其原因还有待后续进一步验证。
其次，通过考察健康组和龋病组的唾液菌群结构差异，发现龋病状态是影响菌群结构变异的最重要因素，且H组和C组菌群结构具有明显区分性，说明龋病的发生并不是某种特异性微生物的作用结果，而是口腔生物膜菌群结构整体发生的改变，这亦与“生态菌斑假说”的理论相一致[7]。特别的是，H组样本彼此间变异较大，而C组样本间唾液菌群相对保守度高，这提示龋病的发生模式可能较为一致。值得注意的是，既往的儿童龋病纵向研究[9]和成年人龋活跃者元基因组学研究中[6]亦发现健康和龋病者菌群结构上存在显著差异，但在低龄儿童龋病的横断面研究[10-12]中较难检测到。本研究发现差异的可能原因是研究对象均为重症龋病者（dmft≥10），两组的口腔健康状态表型差异较大，且采用了较为灵敏的多元统计学方法。这一结果提示，当无法进行纵向实验设计剔除个体背景干扰因素时，选取疾病状态较为严重的极端样本可较易挖掘疾病发生的一定内部规律。
然后，对于种系发育信息的结果，本研究得出的主要细菌门构成与既往关于儿童口腔牙菌斑的研究[10-11,13]相互验证，但在两组人群中无明显差异。本研究未发现有该类“龋特异性”细菌存在，但观察到在两组人群中丰度存在显著差异的“龋相关性”细菌种类。在细菌属水平，S-ECC者检测到显著增加的（增加约7%丰度）Prevotella属，且发现此属的更高级分类亦在S-ECC组中高表达，包括纲水平上的Bacteroides，目水平上的Bacteroidales，科水平上的Prevotellaceae。Prevotella为无芽孢革兰阴性厌氧杆菌，体外培养时缺乏致龋相关的产酸特性，仅具备中度耐酸能力[14]，并非常规意义上讲的致龋性较强的细菌，如Streptococci mutans或Lactobacilli等[15]；但是其他一系列依赖相同或者不同技术手段的龋病菌群研究[9,16-17]也有类似结果，即发现Prevotella与龋病关系密切。Simón-Soro等[18]发现，在牙本质龋样品中胶原酶过量表达，而该基因主要来源于升高的Prevotella属，提示Prevotella可能并非通过传统的致龋特性（产酸、耐酸等）参与了牙体组织脱矿而诱发龋病，而是潜在性地通过自身的蛋白溶解特性参与了龋病发展这一过程。
最后，龋病风险评估已经成为了当今龋病研究的一个重点问题，也是现代龋病防治的重要组成部分[5]。本研究基于唾液菌群细菌属和筛选的4个菌属，分别建立了龋病风险评估模型，区分健康和龋病样品的准确率均可以达到70%以上；特别是基于筛选的4个微生物因子的龋病评估模型与基于全菌谱的龋病评估模型性能较为相似，这一结果提示可以利用这4个菌属建立快速、准确而便捷的龋病风险评估方法。
[参考文献]（略）
详见《华西口腔医学杂志》2018年4月第36卷第2期
