生物钟基因对骨改建的影响
邓旭亮
专家介绍：邓旭亮，男，1972年2月生，北京大学口腔医院科研副院长，特诊科主任、教授、主任医师，博士生导师，中国生物医用材料产业技术创新战略联盟副理事长，生物医用材料北京实验室副主任，中国生物医学工程学会生物材料分会理事。2016年入选科技部中组部“万人计划”，获第七届“全国优秀科技工作者”，获第十一届光华工程科技奖青年奖，2015年获长江学者特聘教授，2014年度获国家杰出青年科学基金资助，2013年获选科技部中青年科技创新领军人才，2013年作为第一完成人获教育部 “高等学校科学研究优秀成果奖”技术发明二等奖，2009年入选教育部“新世纪优秀人才”计划。近年来作为项目负责人主持了21项科研项目，其中国家自然科学基金项目6项、国家863项目4项、科技部国际合作项目、教育部新世纪优秀人才支持项目、卫生部行业科研专项课题、北京市科技计划等，并作为主要完成人和学术骨干参加了国家及省部级科研项目14项。从口腔关键材料的临床应用特点及存在的问题出发，在新型口腔树脂基修复材料及引导组织再生支架材料的组成、结构设计、制备和功能仿生、纳米效应发挥及组织修复机理等方面进行了长期基础研究，获得了多项重要的理论研究进展和应用参加成果。发表论文177篇，其中SCI收录论文65篇，其中通信作者40篇（近五年44篇，其中通讯作者27篇），总被引用743次（SCI他引677次），单篇引用最高111次，申请25项国家发明专利（其中第一发明人申请7项），授权13项，获国药局Ⅲ类医疗器械注册证3个，国内外学术特邀报告11次，其中含大会报告5次（国际2次，国内3次），已经指导硕士研究生25名，博士生7名。
摘要
生物体的生理、生化和行为的周期性震荡称为生物节律，由生物钟基因调控。数十种核心钟基因中，Clock和Bmal1最早被发现，并且作为整个时钟体系的起始因子。而骨再生和改建是解决当今口腔医学重要的前沿科学问题。因此本文以钟基因和骨改建两者关系为题，了解生物钟基因的基本机制，以及生物钟基因可能对骨改建造成的影响，初步探讨Clock和Bmal1基因对再生和骨改建的调控机制，总结近年来生物钟基因影响骨改建的研究进展。
1 生物钟基因的特点
昼夜节律是持续运行并且以大约24 h为周期的生物节律，是生物体的生理、生化和行为的周期性震荡，是所有生物体对可预测的环境改变的一种综合性适应，这几乎是所有真核生物和部分原核生物的基本特征［1］。从单细胞生物到人，从体温的波动、激素水平的涨落、识别和记忆能力的变化等都呈昼夜节律性。而在日常生活中，最明显的昼夜节律是睡眠-觉醒这一生理变化。有两种机制精确地控制着睡眠和觉醒的时间：一是机体状态平衡机制，即睡眠稳态调节；另一个是昼夜节律，即在24 h内，人体的生理机制会出现盛衰变化，从而调节睡眠时相［2］。这两种机制的相互协调，影响着睡眠的时间点、长度、质量以及醒后人体的各种机能状况，使得身体在需要时睡觉，在得到满足后醒来［3］。
昼夜节律发生的结构基础是分子计时器，即昼夜节律生物钟，从哺乳动物到细菌的大多数生物体都有这样一个计时装置［4］。早在2002年，有研究发现在哺乳动物中，下丘脑的视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）是实现这一神经系统功能的重要核团，因而被称为中枢生物钟［5］。中枢生物钟可以通过眼睛的特殊光感受器来感受外界环境明暗变化，再通过视网膜神经节细胞（非视细胞或视色素）将信息通过视网膜下丘脑束传递至SCN腹外侧部即“视网膜-下丘脑信号通路”，从而导引位于SCN的主生物钟的节律性振荡，使输出节律与太阳昼夜的变化一致。它使各种生命活动（如体温、血压、激素分泌量、骨发育等）每天有节律并且有序的表现出来。
随着研究进展，截至2011年，人们已经发现10余个核心生物钟基因，比如Clock、Bmal1、Pers、Cry、Tim、Tau等，这些核心生物钟基因在细胞内互相作用，形成一系列的转录/翻译的反馈环来调控彼此的表达量，从而使这些基因在恒定的光照-黑暗周期中呈现节律性的表达［6-7］。基因启动子内的E-box序列（常规形式：CACGTG，非常规形式CACGTT等）是这些基因进行转录调控的目标［8］。核心钟基因按其对基因转录的调控作用分为两大类：Clock和Bmal1被归为正向调控部分；Cry1、Cry2、Per1和Per2被归为负向调控部分［9］。
2006年，研究发现生物钟基因的分子运行机制大致是：Bmal1与Clock蛋白互为分子伴侣，二者相互结合成Bmal1/Clock异二聚体。Bmal1和Clock基因形成中心振荡环的正向元件。Bmal1基因作为时钟体系的起始因子，以Bmal1/Clock异二聚体的形式与靶基因启动子的E-box元件结合，最常见的是与含有CACGTG核苷酸序列的E-Box之间有着高度亲和力（也有CACGTT的非常规的表现形式），然后驱动3个周期基因（Per1、Per2和Per3）、2个隐花色素（Cry1和Cry2）和转录阻抑物REV-ERBA基因的节律转录，继而Per和Cry蛋白形成复合体进入细胞核，抑制Bmal1/Clock二聚体的活性，构成反馈的负向环路，产生时钟节律［10-11］（图1）。
图1 生物钟基因的分子运行机制
随着研究的进展，发现生物钟基因的分子运行机制不仅存在于作为中枢的SCN中，在周围组织（心脏、肝脏、肾脏、成纤维细胞和外周淋巴细胞等）也存在生物钟基因的表达［12］，也同样参与调解各种已分化细胞或干细胞内独特生命活动的昼夜节律。生物钟基因在细胞分裂、骨形成、能量代谢、肿瘤形成等多种重要生理过程中起到重要作用。周边组织的生物钟受到中枢生物钟的严密调控。实验表明，在SCN破坏的情况下，周边组织的整体生物节律也逐渐消失［13］。因此，生物钟基因在机体的平衡调控中起到关键作用。
2 生物钟基因对骨改建的调控
骨骼系统是机体的主体系统，是一种高活性组织。骨骼系统的发生在胚胎早期就已经开始，但在之后的一生中还会不断改建和更新，以修复自身微损伤、保持骨组织结构、行使负重等功能。研究表明，人类每年有10%的骨改建代谢重建，骨骼系统的内稳态平衡就是靠骨重建来实现的［14］。骨形成的过程包括两种方式：软骨内成骨和骨膜内成骨。对成年期的骨骼来说，骨形成只发生在骨缺损需要重建的位置。骨改建包括骨吸收和骨形成两个方面，涉及到覆盖在骨骼表面的骨衬细胞皱缩、破骨细胞填补位置，并将钙化的基质吸收形成骨陷窝，以及成骨细胞进入骨陷窝重新充填新的骨质［15-16］。
近十年来，很多文献表明了生物钟基因与骨形成和骨改建存在着联系。目前的研究大多还局限在小鼠模型上。生物钟基因缺失在小鼠上不仅体现出明显的昼夜节律紊乱，同时也伴有活动减少、体重减轻、生命延长等表现［17］。有研究显示，将离体小鼠软骨细胞培养于三维海绵中，通过对位于骨性关节炎软骨细胞的细胞浆、细胞骨架、细胞核中的12 000多种基因的DNA微点阵分析发现：生物钟基因Clock以及Per1、Per2在软骨中均有表达，并呈现典型的昼夜节律［18］。
近些年的研究发现，生物钟基因在骨细胞中也有表达，并且调控骨重建的过程。生物钟基因Per1、Per2、Cry1、Cry2基因的敲除将会导致整个小鼠的骨体积变大，而不会造成身体组分的改变和其他明显的代谢紊乱。Per2的功能性敲除导致雌鼠骨体积呈现年龄依赖性增长［19］。有研究也表明，在Per2-Brdm1突变小鼠中，骨形成速率大量提高，但是成骨细胞和破骨细胞的数量并没有增加，可能主要是因为调节成骨细胞活性因子释放的功能发生了改变［20］。在Cry2-/-小鼠中，成骨细胞的活性没有明显改变，但是破骨细胞的活性被降低，从而骨吸收的速率降低，导致这类小鼠有比较高的骨体积［21］，这与在Per2 Brdm1突变小鼠中观察到的骨表性不同，进一步表明生物钟基因在调控骨平衡中各自起着不同的作用。
1997年，Ikeda和Nomura研究小组首先命名了Bmal1。Bmal1基因又名Mop3、芳烃受体核转位蛋白3（aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator 3，ARNT3）基因，是一种调节生物节律的重要转录因子，其表达产物Bmal1蛋白是正反馈环路的调节因子之一。Honma等［22］的进一步研究中，在人的基因组已得到的体外表达的小段序列中，发现了Bmal1基因是一段含有碱性螺旋-环-螺旋（PAS）结构域的基因序列，并成功的进行了克隆。
1999年，Takahashi研究小组发布了对人类Clock（hClk）的克隆结果，得到了人类cDNA 编码的Clock蛋白。人类Clock蛋白编码序列为2 538 bp，其中89%与小鼠类似；hClk定位于4号染色体长臂（4q12），含20个外显子，其内含子、外显子的组成也与小鼠一样，这将是小鼠模型的实验结果可能同样适用于人的依据［23］。
2014年，在小鼠模型组织学水平的研究中发现，Clock基因敲除能够促进骨密度的增加，同时引起骨小梁数量、厚度、骨体积比以及皮质骨厚度的增加，骨小梁间隔变小；Bmal1基因敲除导致骨密度的减少，同时引起骨小梁数量、厚度、骨体积比以及皮质骨厚度的减少，骨小梁间隔变大。该实验在细胞学水平上的研究认为：Clock基因促进骨的生长和发育主要是促进成骨细胞的分化和矿化；而Bmal1基因抑制骨的形成和发育主要从抑制成骨细胞的分化和矿化以及促进破骨细胞的增殖两个方面［24］。
近年，可查到的文献还仅限于Clock基因和Bmal1基因对骨改建的影响，而其他核心钟基因对骨改建的影响还有待进一步研究。
3 生物钟基因与血管生长的关系
文献表明，血管内皮生长因子（VEGF）可以促进骨愈合及移植骨内成骨［25］。所以，生物钟基因可能通过影响血管内皮生长因子表达等方式间接影响成骨。
血管的生长发育受到多因子的调控，如血管生成素1（angiogenin-1，Ang-1）可以稳定血管的生长［26］，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促使血管出芽［27］。在这些因子的相互作用下，血管会以特定的方向出芽并逐渐进行生长，并且不断的重塑最后形成复杂而有层次的血管网络。
2012年，有研究证实脊椎动物体内的生物钟基因可以对血管生长发育起到作用。在斑马鱼体内，Per2和Bmal1对依赖VEGF的血管新生中发挥相反的作用［28］。2015年，有实验利用基因敲除的小鼠模型证实，Per1、Per2和Bmal1基因对正常发育阶段的小鼠的脉管生长没有明显的作用。该研究认为，和斑马鱼模型产生差异的主要原因可能是：第一，在哺乳动物体内Bmal1和Per2可能依然可以调控VEGF的表达，但是调控幅度不足以引起明显血管新生的缺陷；第二，哺乳动物体内存在更完善的代偿机制，从而启动其他信号通路平衡VEGF的表达，保证正常脉管的发育；第三，哺乳动物体内脉管生长的调控机制与斑马鱼相比更加复杂，而这种差异需要更进一步的研究和证据去说明［29］。
4 生物钟基因与骨改建的研究展望
截至2016年4月24日在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的关联词查询，可见近些年对于生物钟基因（Clock gene）与骨改建（Bone remodeling）共同的研究还比较少（图2）。目前生物钟基因的研究大多是和肿瘤等疾病相关，而与调控生长发育的文献较少。研究表明，机体内大约30%基因受生物钟基因调控，所以我们可以猜想，骨的改建是与生物钟基因息息相关的。
图2 NCBI关于生物钟基因与骨改建的相关研究统计（截至2016年4月24日）
研究表明，生物钟大致是48 h节律的震荡方式［30］，而骨的改建是一个长期动态的过程。我们可以猜想骨组织生长发育的节律性是受生物钟节律的影响。但是人体长期骨组织生长研究中，标本采集是很难实现的，所以大多实验都仅仅局限于细胞水平。但是对于完整人体，细胞节律性受到核心生物钟基因的调控，单独的体外细胞实验难以说明其在机体中起到的作用。
当今，骨缺损的患者在口腔修复中很常见，如果能够探究清楚生物钟基因对骨改建的调控，就能通过调控生物钟基因来获得更好的骨改建治疗效果。试想，如果我们可以通过调节饮食睡眠等每天的习惯，就可以提高修复骨缺失的治疗效果，那么就可以对骨量不足患者的临床治疗起到很大帮助。关于生物钟基因对骨改建影响机制我们还知之甚少，但随着研究的深入，这些结果必定会成为我们修复缺损骨组织的重要研究依据。
信息来源：口腔医学杂志
