[摘要]

目的

探讨CCL5/CCR5生物轴在涎腺腺样囊性癌（SACC）细胞嗜神经侵袭中的作用。方法 应用细胞免疫荧光技术和流式细胞术检测SACC-LM细胞中趋化因子受体CCR5的表达；应用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测周围神经细胞培养上清液中趋化因子CCL5的表达。应用流式细胞术检测CCL5对SACC-LM细胞内F肌动蛋白的作用，并通过划痕和侵袭实验观察趋化因子CCL5和其受体CCR5对SACC-LM细胞运动能力和侵袭能力的作用。结果 SACC-LM细胞高表达趋化因子受体CCR5；周围神经原代培养上清液中趋化因子CCL5质量浓度为（359.2±15.8）、（696.4±22.6） pg·mL-1；趋化因子CCL5和其受体CCR5结合后对SACC-LM细胞的运动能力和侵袭能力可以产生促进作用。结论 CCL5/CCR5生物轴可能在SACC细胞嗜神经侵袭中起着重要的作用。

[关键词]

唾液腺； 涎腺腺样囊性癌； CCL5； CCR5； 嗜神经侵袭

涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是一种较少见的恶性肿瘤，对周围神经侵袭的倾向性被视为SACC的特征性生物学行为之一[1]。在临床上，周围神经侵袭（peripheral nerve invasion，PNI）与SACC的扩散、复发和预后密切相关[2-3]。在对SACC周围神经侵袭性的研究中，国内外学者已经发现了许多相关蛋白分子，但仍不能完全解释SACC嗜神经侵袭的机制，随着“肿瘤微环境”学说的出现，学者们逐渐将其机制的研究回归系统化，而不再考虑单一蛋白分子的作用。因此，为了更好地诠释PNI的作用机制，需要有更多的相关蛋白质被发现和研究，以完善PNI的“侵袭相关系统”。

Virchow于1863年首先报告慢性炎症与肿瘤之间存在密切的关系[4]。近几年随着炎症因子与肿瘤之间关系研究的不断深入，趋化因子与肿瘤转移的相关研究越来越受到人们的重视。申志远等[5]通过对临床病理标本的研究发现：趋化因子受体CCR5在人SACC组织中高表达，且与SACC的嗜神经侵袭性密切相关。本研究旨在以前期病理标本研究为基础，通过细胞实验观察趋化因子CCL5/CCR5生物轴对SACC细胞系SACC-LM的趋化性和侵袭性的作用，为CCL5/CCR5生物轴在SACC的PNI中的作用研究提供进一步的理论依据。

1，材料和方法

1.1 实验材料

兔抗人多克隆抗体和CCL5酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒、FITC标记的荧光二抗（PeproTech公司，美国）；Transwell小室（Corning公司，美国）；Matrigel胶（BD公司，美国）；人重组活性蛋白CCL5（上海普欣公司）；罗丹明标记的鬼笔环肽抗体（Sigma公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将人SACC细胞系SACC-LM（图1）置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37 ℃，5%CO2孵育箱条件下培养。术中颈淋巴组织清扫所得人周围神经在无菌条件下采用组织块法进行原代培养，仅收集细胞培养的上清液。

1.2.2 细胞免疫荧光法检测趋化因子受体CCR5在SACC-LM细胞中的表达

将对数生长期的SACC-LM细胞接种至12 mm×12 mm的小方片上，孵育箱内孵育24 h，采用PBS清洗3次，4%的多聚甲醛进行固定15 min，PBS再次清洗3次，0.5%Triton X-100覆盖细胞，37 ℃孵育10 min，PBS洗涤3次后孵育一抗，即采用1%的BSA将一抗稀释至所需浓度（1︰100稀释），滴加至小方片上将细胞覆盖。置于4 ℃冰箱内过夜后次日37 ℃条件下复温30 min，PBS洗涤3次，然后孵育荧光二抗工作液，将荧光二抗工作液滴加至细胞表面，37 ℃避光孵育2 h，PBS清洗3次，DAPI染色并置于37 ℃

避光环境下再次孵育15 min，最后避光条件下，PBS清洗3次后，将小方片置于荧光显微镜下观察，以PBS代替一抗稀释液组作为空白对照组。

1.2.3 流式细胞术检测趋化因子受体CCR5在SACC-LM细胞中的表达

取对数生长期的细胞，弃培养液后用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化细胞，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中和胰蛋白酶，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液后再加入含3%胎牛血清的PBS离心清洗1次，将细胞重悬后转移至1.5 mL的EP管中，1 000 r·min-1离心5 min沉淀细胞后，加入100 μL一抗稀释液（1︰100），置于37 ℃恒温孵育箱中孵育30 min，PBS离心清洗2次，加入FITC标记的荧光二抗稀释液，37 ℃孵育箱中避光孵育30 min，PBS离心清洗2次，4%多聚甲醛固定样本。以未加一抗稀释液组作为空白对照组。

1.2.4 ELISA法测定人周围神经细胞原代培养上清液中趋化因子CCL5的含量

手术切取的周围神经标本无菌操作下立即放于含有1 000 U·L-1双抗液的培养基内，常温下放置5 min。显微镜下去净神经组织周围的血块及黏膜，用组织剪剪成约1 mm×1 mm×1 mm的小块，贴于25 mL塑料培养瓶壁上，加入适量的含15%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃恒温贴壁2 h后翻瓶并加入适量的培养液。细胞爬出后，PBS液清洗3次，加入无血清的培养液培养2 h，将培养液弃掉更换无血清培养液后培养12 h和24 h，并分别收集上清液。采用CCL5检测试剂盒检测样品中的CCL5表达量。以新鲜的无血清DMEM培养液作为阴性对照，按试剂盒说明书进行操作。每个样品ELISA法至少检测3个孔，均数间的比较采用t检验。

1.2.5 流式细胞仪检测SACC-LM细胞经CCL5处理前后细胞内F肌动蛋白量的变化

取对数生长期的细胞，弃培养液后用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中和胰蛋白酶，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液后再加入含3%胎牛血清的PBS离心清洗1次，将细胞重悬后转移至1.5 mL的EP管中，1 000 r·min-1离心5 min沉淀细胞后，加入浓度为100 ng·mL-1的CCL5无血清RPMI1640（200 μL），37 ℃孵育30 min后，离心洗涤2次，滴加罗丹明标记的鬼笔环肽抗体（1︰100稀释）并重悬，37 ℃避光孵育30 min，利用流式细胞仪检测荧光强度平均值。以加入无血清RPMI1640（200 μL）作为空白对照组。

1.2.6 划痕实验观察CCL5对SACC-LM细胞运动能力的影响

将细胞以每孔2×105个的密度接种于24孔培养板中，待细胞长到单层完全融合时，用10 μL Tip枪头在单层细胞上划痕，建立细胞划痕模型，并用PBS清洗2次。加入含CCL5（20 ng·mL-1）的无血清RPMI1640培养基，37 ℃孵育箱内继续培养，用倒置显微镜于0、48 h观察划痕愈合程度。以单纯加入无血清RPMI1640培养基作为空白对照组。

1.2.7 侵袭实验观察CCL5对SACC-LM细胞侵袭能力的影响

Transwell小室内为孔径8 μm的多聚碳酸酯膜，用Matrigel胶（1︰5稀释）包被后放置于专用的24孔细胞培养板内，选用对数生长期的SACC-LM细胞，血清饥饿12 h后，将细胞放于上室内，在下室中，加入600 μL含不同浓度趋化因子CCL5的无血清RPMI 1640培养液（0、10、20、50、100、300、500 ng·mL-1），并将培养板置于孵育箱内孵育12 h。每组设3个复孔，以在下孔中加入不含CCL5的无血清RPMI1640培养液作为空白对照组。取出嵌套小室，将上室多聚碳酸酯膜内面的细胞用棉签擦净，将膜底面的细胞用多聚甲醛固定，并用苏木素和伊红进行细胞染色，显微镜下读取多聚碳酸酯膜底面穿过的细胞数目。统计学处理：于放大200倍光学显微镜下选取5个视野，记录穿过多聚碳酸酯膜的细胞总数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件包对所得数据进行统计学分析。P<0.05说明研究结果的差异具有统计学意义。

2 ，结果

2.1 细胞免疫荧光法和流式细胞术检测趋化因子受体CCR5在SACC-LM细胞中的表达结果

细胞免疫荧光法和流式细胞术均发现SACC-LM细胞可以表达趋化因子受体CCR5（图2）。

由图2可见，在细胞免疫荧光实验中，荧光显微镜下观察趋化因子受体CCR5表达阳性的细胞，呈现出绿色荧光；利用CCR5抗体+流式细胞术同样发现SACC-LM细胞有趋化因子受体CCR5的表达，其阳性表达率为81.9%。

2.2 ELISA测定结果

ELISA法测定人周围神经细胞原代培养上清液中趋化因子CCL5的表达量为（359.2±15.8）、（696.4±22.6） pg·mL-1，均比空白对照组多（P<0.05）（图3）。

2.3 流式细胞术检测细胞内F肌动蛋白量的变化

加入趋化因子CCL5孵育30 min后，利用流式细胞仪检测SACC-LM细胞内F肌动蛋白的荧光表达强度，进而反应细胞内F肌动蛋白量的多少。实验组中F肌动蛋白的荧光表达强度为82.8%，明显高于空白对照组（图4）。

2.4 划痕实验和侵袭实验结果

相同时间段内实验组SACC-LM细胞划痕模型的愈合速度明显高于空白对照组（图5）；侵袭实验中，加入趋化因子CCL5后各实验组穿越PC膜的细胞数目均有明显上升，当趋化因子CCL5的浓度为20 ng·mL-1时，穿越PC膜的细胞数最多（图6）。

3，讨论

恶性肿瘤细胞的侵袭和转移是一个连续的、复杂的、系统性的过程，具有高度的特异性，虽然国内外学者已经证明恶性肿瘤细胞的侵袭和转移是一个多因素参与的过程，但不同组织学类型的恶性肿瘤进行特定的侵袭和转移的分子机制尚不清楚。趋化

因子可以调控细胞的迁移，其与相应受体的结合可以引起细胞骨架蛋白的改变，使得细胞形成更多的伪足，进而促进了细胞的运动性，这是恶性肿瘤发生侵袭和转移的前提条件[6-7]。随着趋化因子研究的不断深入，其在恶性肿瘤中的作用已经被多数

学者作为“肿瘤微环境学说”的重要机制之一。趋化因子CCL5，属于CC趋化因子家族的成员，具有介导免疫细胞定向趋化的作用[8-9]，其受体有3个，分别是CCR1、CCR3和CCR5，其中以CCL5与CCR5的亲和力最强，构成了CCL5/CCR5生物轴。国内外许多

学者[10-11]认为趋化因子CCL5和其受体CCR5在恶性肿瘤的侵袭和转移中扮演着重要的角色。有研究[11-12]表明，趋化因子CCL5与前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌的侵袭与转移密切相关。研究[13-15]发现CCL5/CCR5生物轴可引起乳腺癌细胞内细胞骨架蛋

白的重排，使细胞的运动性增加，促进了癌细胞的浸润与转移。在笔者前期的实验[16]中，发现CCL5/CCR5生物轴存在于人唾液腺SACC和周围神经之间的“微环境”中，并且通过体外细胞实验证明趋化因子CCL5可以明显地促进SACC细胞的趋化和侵袭能

力，这说明CCL5/CCR5生物轴可能在SACC易侵袭周围神经中起着重要作用。但是，CCL5/CCR5生物轴在SACC细胞嗜神经侵袭中的具体分子作用机制尚需进一步的研究。

综上所述，本研究通过细胞免疫荧光技术证实了趋化因子受体CCR5在SACC-LM细胞中的存在，利用ELISA法检测到了周围神经细胞可以外分泌趋化因子CCL5。为了观察趋化因子CCL5对SACC-LM细胞运动能力的影响，笔者通过流式细胞术检测到趋化因子

CCL5促进了SACC-LM细胞内F肌动蛋白的增多，这是细胞运动性增强的标志之一；而后又在划痕、侵袭实验中，从宏观角度观察到了CCL5/CCR5生物轴对SACC-LM细胞迁移及侵袭能力的促进作用。以上结果说明CCL5/CCR5生物轴在SACC细胞嗜神经侵袭中可

能扮有重要的角色，有利于进一步研究唾液腺SACC嗜神经侵袭的机制。

来源：原创 李添翼 申志远 华西口腔医学杂志