来源：《华西口腔医学杂志》2016年4月第34卷第2期

作者：高敬 黄文明（通讯作者）

作者单位：重庆医科大学附属口腔医院牙体牙髓病科·口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室·重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147

[摘要] 目的 研究变异链球菌耐酸毒力因子质子移位膜ATP酶（F-ATPase）在不同pH环境和龋病发生发展过程中的表达，评价F-ATPase在龋病进展中的动态变化。方法将变异链球菌菌悬液在不同pH（pH4.0~7.0）和不同葡萄糖浓度（含5%和不含葡萄糖）的BHI液体培养基中培养，检测F-ATPase基因的表达水平。将雄性Wistar大鼠随机分成致龋组和对照组，其中致龋组喂养致龋饲料及5%葡萄糖水，对照组喂养普通饲料。每2周采集菌斑样本，检测F-ATPase基因的表达水平。第11周时取大鼠上下颌骨标本，对磨牙进行龋损评定。结果 1）5%葡萄糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达高于不含葡萄糖（P<0.05），在pH5.0时F-ATPase基因的表达最高，pH4.0时表达最低（P<0.05）。2）成功构建了龋病动物模型，在龋病发生发展过程中，致龋组和对照组F-ATPase的表达逐渐增强，致龋组表达高于对照组（P<0.05）。结论 耐酸毒力因子F-ATPase的表达变化与龋病的发生发展密切相关。

[关键词]龋病；牙菌斑；质子移位膜ATP酶；pH

耐酸性是细菌在致龋过程中最重要的毒力表现，细菌产酸后若不能耐酸， 则细菌就不能继续生存、代谢。Bender等[1]研究发现细菌的耐酸性与细菌膜对质子的透过性有关，变异链球菌的耐酸性主要依赖于细胞膜上的质子移位膜ATP酶（membranebound proton-translocatingATPase，F-ATPase），通过F-ATPase将质子泵出胞内，使胞内pH（pHi）高于胞外pH（pHo），即维持了一个跨膜梯度ΔpH（pHi-pHo），保持胞内pH接近中性，保护胞浆中与糖酵解相关酶的活性，使菌细胞在低pH的苛刻环境中仍能产酸、生存并最终导致龋病的发生[2-3]。可见，F-ATPase是变异链球菌致龋菌耐酸的引擎和马达，与龋病的发生密切相关。

目前尚缺乏关于变异链球菌耐酸毒力因子FATPase在龋病发生发展过程中的研究，为了进一步了解F-ATPase在龋病进展中的变化，本研究建立致龋动物模型纵向研究F-ATPase基因在龋病进展中的表达变化，比较F-ATPase基因在不同pH环境的表达，以评价生物膜中耐酸毒力因子F-ATPase与龋病发生的关系。

1 材料和方法

1.1 实验菌株及动物

变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）标准株UA159由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。18 d龄的雄性Wistar大鼠购于重庆医科大学实验动物中心，许可证编号为SYXK（渝）2012-0001。

1.2 主要试剂及仪器

BHI培养基（OXOID公司，英国），YJ-875型超净工作台（苏州市华宇净化设备有限公司），FQ-聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（Bio-Rad公司，美国） ，200型分光光度计（Thermo Fisher公司，美国），pH计（Mettler Toledo公司，瑞士），Bio-Rad电泳仪（Bio-Rad公司，美国）。

1.3 引物设计

根据GenBank报道的变异链球菌F-ATPase β亚基基因[4]序列及16sRNA基因序列（GenBankaccession number NC_004350），采用Primer primer 5.0计算机软件设计引物。F-ATPase上游引物 5’-CGGATGCGTGTTGCTCTTACTG-3’，下游引物5’-GGCTGATAACCAACGGCTGATG-3’；16sRNA上游引物5’-TGGAACTGAGACACGGTCCA-3’，下游引物5’-CGCTTTACGCCCAGTAATTCCG-3’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 不同pH和葡萄糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达

将变异链球菌标准株UA159复苏，培养24 h，3 000 r·min-1离心15 min， 弃上清，用无菌生理盐水于紫外分光光度计540 nm处制备成吸光度为1.0的菌悬液备用。以0.5为间隔配制pH4.0~7.0系列的含5%葡萄糖和不含葡萄糖的BHI液体培养基。取变异链球菌悬液，按菌液与BHI液体培养基1∶10的体积比接种细菌 ，37 ℃厌氧培养至16 h指数生长期，每个样品一式3份，3 000 r·min-1离心 15 min收集菌体，通过RNAiso Plus（Takara公司，日本）提取RNA，逆转录成 cDNA，PCR扩增反应总体积为20 μL，含SYBR Premix Ex Taq（2x）10 μL （包括DNA Taq酶、Mg2+、dNTP、SYBR GreenⅠ荧光染料和Buffer缓冲液）、上下游引物各0.5 μL、模板cDNA 2 μL，加灭菌去离子水至20 μL。反应循环参数设置为三步法PCR扩增标准程序：95 ℃预变性3min，95 ℃变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。在延伸阶段收集荧光信号，循环结束后附加溶解曲线分析：95 ℃ 15 s，62 ℃ 23 s，95 ℃ 15 s。实验重复3次， 取均值，收集实验数据，测定各样品的循环阈值（Ct值），通过2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

1.5 龋病动物模型的建立及变异链球菌F-ATPase基因表达检测

12只18 d龄的雄性Wistar大鼠，随机分为2组，致龋组6只，喂养致龋饲料2 000号及5%葡萄糖水；对照组6只，喂养普通饲料。从第1周开始每2周采集菌斑样本（共6次），采集样本前2 h大鼠禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，以棉拭子采集磨牙面及颊舌（颊腭）面的菌斑，置于含硫乙醇酸盐传送液的离心管中洗脱，将样本收集于离心管中，提取混合菌斑RNA，进行逆转录和实时荧光定量PCR（引物及反应体系同上）。结果取均值，通过2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

第11周时处死大鼠，取上下颌骨标本，染色，根据Keyes经典评分方法[5] 对磨牙进行龋损评定，将龋损分为4级。E级：仅限于釉质；Ds级：累及釉质及牙本质外层1/4以内；Dm级：累及牙本质厚度的1/4至3/4；Dx级：累及超过牙本质厚度的3/4，甚至达牙本质全层。

1.6 数据分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差表示，多组之间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 变异链球菌F-ATPase基因及16sRNA内参基因

F-ATPase基因和16sRNA内参基因经常规PCR都能得到特异性扩增，2%凝胶电泳显示各基因各实验组中的cDNA产物均为单一条带（图1、2），条带片段大小与引物预期扩增片段大小一致。

2.2 不同pH和葡萄糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达

不同pH和葡萄糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达见图3。实验结果显示，1）在pH5.0时FATPase基因的表达最高，然后依次是pH5.5、6.0、6.5， 7.0，4.5，最低的是pH4.0（P<0.05）；2）5%葡萄糖浓度下F-ATPase的表达高于不含葡萄糖（P<0.05）。

2.3 大鼠磨牙龋病动物模型的建立

11周后处死大鼠，取磨牙进行Keyes评分，结果见图4和表1。实验成功构建了龋病动物模型，各组Wistar大鼠磨牙均有不同程度的龋损发生，但是龋损发生的严重程度、累及范围不尽相同。致龋组龋齿计分明显高于对照组，且龋坏病变的程度要高于对照组。对照组牙齿的损坏最小，仅达到牙本质中层，致龋组龋损多数达牙本质中层，其次是牙本质深层。

2.4 龋病过程中F-ATPase基因的表达

龋病过程中各组F-ATPase基因的表达见表2。在龋病的发生发展过程中，随时间的推移各组F-ATPase基因的表达逐渐增强，致龋组表达高于对照组（P<0.05），第9周后，致龋组增长程度有一定下降，对照组的表达下降。

3 讨论

F-ATPase具有调节胞浆pH以及决定菌细胞耐酸性的生物学特性。细菌细胞的胞外质子向胞内扩散降低胞内pH，影响对酸敏感的糖酵解的活性，为了最大程度的发挥糖酵解的活性，致龋菌通过细胞膜和F-ATPase抵抗胞浆的酸化，F-ATPase将质子泵出细胞从而调节pH，使致龋菌在低pH值环境下仍能进行糖酵解 [6-7]。

早期龋病研究表明，环境pH和糖在龋病的发生发展过程中起着重要的作用 ，而口腔原位环境是一个复杂且动态变化的环境，获取大鼠致龋过程中牙菌斑pH较困难，为了研究高糖浓度下变异链球菌FATPase基因的表达与pH之间的关系 ，本研究设计了体外实验，结果显示，变异链球菌在5%葡萄糖浓度下耐酸毒力因子F-ATPase表达高于不含葡萄糖环境。研究[8]表明，在高糖浓度下，变异链球菌的黏附毒力、产酸毒力、耐酸毒力及耐药毒力均高于低糖或无糖环境下， 由此推测，高糖浓度下变异链球菌致龋能力上调。当外界环境中有充足的糖源时，变异链球菌能迅速合成胞外多糖，伴随着产酸耐酸能力的增强，环境中pH迅速下降，变异链球菌在酸压力状态下通过上调耐酸因子F-ATPase表达来维持生存代谢。Kuhnert等[4]对浮游状态的变异链球菌F-ATPase基因表达研究证实 ，在pH5.0时mRNA的表达水平大约是pH7.0时的2倍。研究[9]发现，当培养基中的pH由8.0下降至5.0时，变异链球菌的F-ATPase活性提高4倍，从而增强了其质子泵作用。本实验研究也证实，高糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达高于无糖或低糖环境，F-ATPase的表达在pH5.0时最高，pH4.0时最低，pH5.0到7.0时F-ATPase表达缓慢降低，在pH5.0以下时F-ATPase的表达急剧减少。学者[10]研究对比了干酪乳杆菌、变异链球菌和血链球菌3种耐酸性分别为高、中、低的口腔耐酸菌膜结合F-ATPase的pH活性范围，发现其最适pH值分别为5.5、6.0和7.0，证明了细菌的相对耐酸性与F-ATPase的活性和最适pH值有关，活性越大，最适pH值越低。在酸性环境中排除胞内多余H+能力越强，因而越耐酸。可见在最适pH以内，F-ATPase的表达随pH降低而升高，而当pH降低至5.0以下时，酶活性超过最适pH使F-ATPase的表达量下降，同时强酸的环境压力可以使细菌合成ATP不足，并破坏细胞质内的蛋白结构使之死亡[11]。通过对大肠杆菌的研究，Kasimoglu等[12]发现，F-ATPase的表达量在转录和翻译水平的调控是多层次的，其中细菌的生长率在F-ATPase的产生和表达中起着比较重要的作用，大量细菌死亡也会导致生物膜中F-ATPase的表达量大大减少。同样在pH5.0以下的环境，随着变异链球菌的大量死亡，F-ATPase的基因表达在高糖和无糖环境中差异较小。

龋齿Keyes评分结果显示，致龋组龋齿计分明显高于对照组，且龋坏病变的程度要高于对照组，证明本实验龋齿模型的建立成功。实验中所使用的致龋饲料为高糖饲料，大鼠牙菌斑长期暴露在高糖的环境中，致龋菌有足够的底物产酸，造成牙菌斑内pH持续下降，在龋病发生发展过程中，致龋组和对照组F-ATPase表达均逐渐增强，致龋组表达高于对照组，第9周后，致龋组增长程度有一定下降，对照组的表达有一定下降。在实验过程中第5周时大鼠龋坏开始出现， 在龋坏启动前期，变异链球菌等致龋菌大量产酸，使菌斑内pH达到脱矿临界值pH5.0~5.5。F-ATPase是一种应激蛋白，当外界环境pH下降时，变异链球菌F-ATPase基因表达上调，从而合成更多的F-ATPase蛋白以排除更多的氢离子维持细菌的生存，当更多的氢离子排到外环境时，环境中的pH继续下降酸蚀牙齿致龋。当龋病发展到第9周时，牙菌斑内微生物已经形成一个稳定的动态平衡状态，随着唾液蛋白等的中和缓冲作用，牙菌斑内pH值上升[13]，F-ATPase表达下调。学者[14]分离临床牙菌斑中变异链球菌，结果表明高龋牙菌斑变异链球菌分离株黏附、产酸和耐酸能力高于无龋牙菌斑分离株。本实验中致龋组耐酸因子表达亦高于对照组。对照组大鼠使用的普通饲料内碳水化合物含量较低，大鼠本身的口腔自洁能力较强，唾液分泌较多，对菌斑内pH缓冲能力强，使菌斑pH维持在一个稳定的范围，F-ATPase的表达也维持在一个稳定的范围。

本文对变异链球菌耐酸毒力因子F-ATPase在不同pH中的基因表达进行了研究，并建立了大鼠致龋模型，结果显示，变异链球菌F-ATPase在pH5.0时表达最高，致龋组大鼠在龋病发展过程中F-ATPase表达上调，提示耐酸毒力因子F-ATPase在釉质脱矿及龋病的形成中发挥着重要的作用。